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sdjnyxn123

银虫 (小有名气)

[求助] 求帮忙分析一下关于PCR产物电泳图片 已有1人参与

本来打算做巢式PCR,设计了两对引物,可是做出来之后看电泳结果反而不如之前用一对引物的明显了···

一个是先用外侧正反引物做touch down,产物作为模板,用内侧正反引物进行PCR;
另一个是直接用内侧的正反引物做个touch down然后用产物做模板进行PCR

另外,分别用三种不同的海参组织cDNA做模板进行实验(肠道、体壁、呼吸树)


小弟是个刚开始学分子生物学的新手,希望能帮忙分析一下出现这种现象的原因是什么呢?
为什么第二个体壁的电泳条带是那样的呢?
前面三个是不是除了引物二聚体还有别的东西在里面呢?
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bwangel

银虫 (小有名气)

2楼2014-09-28 08:22:02
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cuihao102

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-09-28 09:26:50
首先,可以试试目的引物直接PCR,调整好条件,既然你说“可是做出来之后看电泳结果反而不如之前用一对引物的明显了”,说明这样应该是可行的,只是条件没有优化。
其次,并不是touch down就一定比正常的PCR要好,只有后者实在行不通才试用touch down。
另外,可以先用外侧引物直接扩增,检验其产物,然后回收,再以其为模板扩增目的产物,因为如果直接在体系中加2对引物也可能会引起错配。
最后,检查一下cDNA质量。
3楼2014-09-28 09:14:23
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sdjnyxn123

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cuihao102 at 2014-09-28 09:14:23
首先,可以试试目的引物直接PCR,调整好条件,既然你说“可是做出来之后看电泳结果反而不如之前用一对引物的明显了”,说明这样应该是可行的,只是条件没有优化。
其次,并不是touch down就一定比正常的PCR要好,只 ...

非常感谢您的回答!
请问电泳图片体壁的那一条为什么会出现那样的情况呢?后面三个好像只有引物二聚体的感觉,那么左边的是不是说很可能有目的片段在里面了呢?
4楼2014-09-28 17:13:53
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cuihao102

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


sdjnyxn123(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-04 22:15:53
不知道你目的产物是多大,看着像是有东西,但也有可能是杂带!如果想确定的话再P一次,重跑一下看看是不是还是这样。
5楼2014-09-28 18:59:21
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狼王啊

铁虫 (初入文坛)

第二次PCR时,把第一次PCR的产物稀释一下做模板,试一试??
6楼2014-09-30 20:45:41
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sdjnyxn123

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 狼王啊 at 2014-09-30 20:45:41
第二次PCR时,把第一次PCR的产物稀释一下做模板,试一试??

之前问了下老师,老师还是让做巢式PCR,但是外侧引物的PCR体系用AD酶替代了r-Taq,最后的电泳结果居然出条带了···当然,还是感谢你的回答!
7楼2014-10-02 19:02:52
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