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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 急 分子克隆遇到问题
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lywachieve

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 急 分子克隆遇到问题

目前一直在做酶分子的定向进化，但是所做分子克隆部分三个月以来一直不成功；因为这是后续试验基础，恳请大家提出宝贵建议，不胜感激；
本人是应用易错PCR方法改造目的基因；即通过改变PCR体系中各组分的比例如Mg离子浓度，添加Mn离子等，模拟自然进化引入错配碱基，从而改变酶的性状。而在此之前已有公司合成载体PET-24a-atsA-N-6His;（即公司已经把目的片段全长与载体连接完成）；而导师的计划是先改造目的片段的控制水解酶性状的一部分（即目的片段部分长度）；由公司设计针对此部分片段的引物；本人进行易错PCR，再对此PCR片段和载体进行双酶切，酶切位点单一，均为粘性末端（NEB公司内切酶；载体和片段同步双酶切，37度双酶同时切2h），酶切后电泳验证；载体胶回收纯化（此时载体已去除了待突变片段，但仍含有控制该酶其他性状的基因）；目的片段用PCR产物回收试剂盒回收纯化（只切掉56bp）；纯化均采用捷瑞试剂盒；载体切8ug回收十几ng/ul约20ul量；目的片段且2ug;回收约20-30ng/ul约30ul量；连接时用TakaRa 的T4 ；比例从1:3-1:10都试过；10ul-20ul化转入商品化DH5a  都无菌落产生，（抗生素抗性无问题，也没有失效）；加倍T4量后有少量菌落，但菌落PCR均无目的条带出现；（菌落PCR体系无问题，以用商品化原质粒转化后挑取单克隆验证有目的条带。）
为探究原因，做以下实验：
  1.针对待突变部分基因做常规PCR，测序示无突变，再依上述方法酶切连接，转化，仍未有菌落长出；
  2.突变目的片段后胶回收纯化，PMD-T19连接测序；刮取平板，混提质粒，双酶切目的片段，以之前切取纯化后的目的片段对照，胶回收纯化目的片段；再与双酶切后载体T4连接，转化商品化DH5a；仍无菌落长出；(连T载体测序示突变未导致酶切位点改变)。

另外，因相关文献鲜有报道只突变目的片段一部分再重组,而往往是针对目的片段全长突变；不知这一点对分子克隆有无影响？
可请各位专家予以指导，不胜感激。
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1楼 2014-09-05 09:49:08
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panda73

金虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 屏蔽内容 2014-09-05 14:58:09
本帖内容被屏蔽
2楼2014-09-05 13:23:30
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panda73

金虫 (小有名气)
如有需要，请联系support@bettermab.com
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3楼2014-09-05 13:24:48
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lywachieve

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by panda73 at 2014-09-05 13:23:30
如果愿意，我们公司可以为你提供相关的技术服务，而且收费合理（5000元左右），1-2周，交付符合客户要求的突变库。

您好，贵公司是采用定点突变的方式改造酶分子吗？还是采用定向进化的方式？谢谢。
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4楼2014-09-05 14:05:57
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lywachieve: 金币+2, ★有帮助, 感谢提供另一种途径 2014-09-06 08:35:54
引用回帖:
4楼: Originally posted by lywachieve at 2014-09-05 14:05:57
您好，贵公司是采用定点突变的方式改造酶分子吗？还是采用定向进化的方式？谢谢。...

基本方案与你采用的策略类似，既利用致错PCR构建突变库（库容量可以超过10E6(一百万）。但不包括后续突变库的筛选。
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5楼2014-09-05 22:39:27
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gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lywachieve(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-06 22:58:18
实验设计没有问题，但是实施方案有问题，不应该进行易错PCR之后再克隆，应该直接在载体上突变，你有快速筛选的办法吗？如果有就好办，没有就够呛
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6楼2014-09-05 22:44:41
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lywachieve

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gastrodia at 2014-09-05 22:44:41
实验设计没有问题，但是实施方案有问题，不应该进行易错PCR之后再克隆，应该直接在载体上突变，你有快速筛选的办法吗？如果有就好办，没有就够呛

直接在载体上突变，你指的是定点突变吗？能不能说的具体一些？是不是易错PCR之后再克隆会容易导致实验不成功？谢谢。
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7楼2014-09-06 08:34:42
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gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
lywachieve: 金币+7 2014-09-09 17:01:21
你的载体大吗，如果不大，可以直接以环式PCR的方式进行突变，有本书叫做In Vitro Mutagenesis Protocols，推荐你看一下
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8楼2014-09-09 16:16:38
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lywachieve

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gastrodia at 2014-09-09 16:16:38
你的载体大吗，如果不大，可以直接以环式PCR的方式进行突变，有本书叫做In Vitro Mutagenesis Protocols，推荐你看一下

载体6906bp;环式PCR中也应用了同源重组（无缝克隆）吗？谢谢。
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9楼2014-09-09 17:01:12
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neer

铁虫 (初入文坛)
你问题解决了吗？我也遇到类似的问题，都愁死了
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10楼2014-10-30 17:04:41
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