| 查看: 2466 | 回复: 9 | |||
lywachieve至尊木虫 (著名写手)
|
[求助]
急 分子克隆遇到问题
|
|
目前一直在做酶分子的定向进化，但是所做分子克隆部分三个月以来一直不成功；因为这是后续试验基础，恳请大家提出宝贵建议，不胜感激； 本人是应用易错PCR方法改造目的基因；即通过改变PCR体系中各组分的比例如Mg离子浓度，添加Mn离子等，模拟自然进化引入错配碱基，从而改变酶的性状。而在此之前已有公司合成载体PET-24a-atsA-N-6His;（即公司已经把目的片段全长与载体连接完成）；而导师的计划是先改造目的片段的控制水解酶性状的一部分（即目的片段部分长度）；由公司设计针对此部分片段的引物；本人进行易错PCR，再对此PCR片段和载体进行双酶切，酶切位点单一，均为粘性末端（NEB公司内切酶；载体和片段同步双酶切，37度双酶同时切2h），酶切后电泳验证；载体胶回收纯化（此时载体已去除了待突变片段，但仍含有控制该酶其他性状的基因）；目的片段用PCR产物回收试剂盒回收纯化（只切掉56bp）；纯化均采用捷瑞试剂盒；载体切8ug回收十几ng/ul约20ul量；目的片段且2ug;回收约20-30ng/ul约30ul量；连接时用TakaRa 的T4 ；比例从1:3-1:10都试过；10ul-20ul化转入商品化DH5a 都无菌落产生，（抗生素抗性无问题，也没有失效）；加倍T4量后有少量菌落，但菌落PCR均无目的条带出现；（菌落PCR体系无问题，以用商品化原质粒转化后挑取单克隆验证有目的条带。） 为探究原因，做以下实验： 1.针对待突变部分基因做常规PCR，测序示无突变，再依上述方法酶切连接，转化，仍未有菌落长出； 2.突变目的片段后胶回收纯化，PMD-T19连接测序；刮取平板，混提质粒，双酶切目的片段，以之前切取纯化后的目的片段对照，胶回收纯化目的片段；再与双酶切后载体T4连接，转化商品化DH5a；仍无菌落长出；(连T载体测序示突变未导致酶切位点改变)。 另外，因相关文献鲜有报道只突变目的片段一部分再重组,而往往是针对目的片段全长突变；不知这一点对分子克隆有无影响？ 可请各位专家予以指导，不胜感激。 |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有148人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有8人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 本人目前遇到连接问题
已经有17人回复
- 感受态转化及阳性克隆出现问题
已经有15人回复
- 求助分子克隆问题——挑不出阳性克隆！
已经有14人回复
- TA克隆电击法转化的步骤
已经有3人回复
- T-A克隆一直做不出来
已经有28人回复
- 感受态细胞污染的问题
已经有10人回复
- 关于PBS的一个问题
已经有5人回复
- 基因克隆中酶切连接问题
已经有13人回复
- 分子克隆的经验交流
已经有19人回复
- 连接转化不成功问题
已经有17人回复
- 转化克隆的问题
已经有5人回复
- 克隆过程出现的问题
已经有7人回复
- 分子克隆遇到了问题
已经有6人回复
- 分子克隆连接问题！
已经有12人回复
- DEPC水配制及用器烘问题？
已经有11人回复
- 【求助/交流】分类鉴定的时候，为什么pcr之后还要做TA克隆，转化，然后将序列测序呢？
已经有5人回复
- 【求助/交流】Thrombin protease切GST问题
已经有4人回复
- 【求助/交流】克隆连接时间
已经有18人回复
- 【求助/交流】单酶切连接的克隆急……
已经有10人回复
- 分子克隆实验指南系列之：美国冷泉港实验室经典:抗体技术实验指南
已经有10人回复
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 屏蔽内容 2014-09-05 14:58:09
gyesang: 屏蔽内容 2014-09-05 14:58:09
|
本帖内容被屏蔽 |
2楼2014-09-05 13:23:30
panda73
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 3
- 应助: 80 (初中生)
- 金币: 1201.3
- 散金: 44
- 红花: 2
- 帖子: 191
- 在线: 42.5小时
- 虫号: 985964
- 注册: 2010-03-30
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
3楼2014-09-05 13:24:48
lywachieve
至尊木虫 (著名写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 14256.8
- 红花: 1
- 帖子: 1894
- 在线: 89.3小时
- 虫号: 2672721
- 注册: 2013-09-22
- 性别: MM
- 专业: 临床检验新技术
4楼2014-09-05 14:05:57
panda73
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 3
- 应助: 80 (初中生)
- 金币: 1201.3
- 散金: 44
- 红花: 2
- 帖子: 191
- 在线: 42.5小时
- 虫号: 985964
- 注册: 2010-03-30
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
5楼2014-09-05 22:39:27
6楼2014-09-05 22:44:41
lywachieve
至尊木虫 (著名写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 14256.8
- 红花: 1
- 帖子: 1894
- 在线: 89.3小时
- 虫号: 2672721
- 注册: 2013-09-22
- 性别: MM
- 专业: 临床检验新技术
7楼2014-09-06 08:34:42
8楼2014-09-09 16:16:38
lywachieve
至尊木虫 (著名写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 14256.8
- 红花: 1
- 帖子: 1894
- 在线: 89.3小时
- 虫号: 2672721
- 注册: 2013-09-22
- 性别: MM
- 专业: 临床检验新技术
9楼2014-09-09 17:01:12
10楼2014-10-30 17:04:41
5