应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 急 分子克隆遇到问题
51/1返回列表
查看: 2438  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

lywachieve

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 急 分子克隆遇到问题

目前一直在做酶分子的定向进化，但是所做分子克隆部分三个月以来一直不成功；因为这是后续试验基础，恳请大家提出宝贵建议，不胜感激；
本人是应用易错PCR方法改造目的基因；即通过改变PCR体系中各组分的比例如Mg离子浓度，添加Mn离子等，模拟自然进化引入错配碱基，从而改变酶的性状。而在此之前已有公司合成载体PET-24a-atsA-N-6His;（即公司已经把目的片段全长与载体连接完成）；而导师的计划是先改造目的片段的控制水解酶性状的一部分（即目的片段部分长度）；由公司设计针对此部分片段的引物；本人进行易错PCR，再对此PCR片段和载体进行双酶切，酶切位点单一，均为粘性末端（NEB公司内切酶；载体和片段同步双酶切，37度双酶同时切2h），酶切后电泳验证；载体胶回收纯化（此时载体已去除了待突变片段，但仍含有控制该酶其他性状的基因）；目的片段用PCR产物回收试剂盒回收纯化（只切掉56bp）；纯化均采用捷瑞试剂盒；载体切8ug回收十几ng/ul约20ul量；目的片段且2ug;回收约20-30ng/ul约30ul量；连接时用TakaRa 的T4 ；比例从1:3-1:10都试过；10ul-20ul化转入商品化DH5a  都无菌落产生，（抗生素抗性无问题，也没有失效）；加倍T4量后有少量菌落，但菌落PCR均无目的条带出现；（菌落PCR体系无问题，以用商品化原质粒转化后挑取单克隆验证有目的条带。）
为探究原因，做以下实验：
  1.针对待突变部分基因做常规PCR，测序示无突变，再依上述方法酶切连接，转化，仍未有菌落长出；
  2.突变目的片段后胶回收纯化，PMD-T19连接测序；刮取平板，混提质粒，双酶切目的片段，以之前切取纯化后的目的片段对照，胶回收纯化目的片段；再与双酶切后载体T4连接，转化商品化DH5a；仍无菌落长出；(连T载体测序示突变未导致酶切位点改变)。

另外，因相关文献鲜有报道只突变目的片段一部分再重组,而往往是针对目的片段全长突变；不知这一点对分子克隆有无影响？
可请各位专家予以指导，不胜感激。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
每天进步多一点
1楼 2014-09-05 09:49:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lywachieve: 金币+2, ★有帮助, 感谢提供另一种途径 2014-09-06 08:35:54
引用回帖:
4楼: Originally posted by lywachieve at 2014-09-05 14:05:57
您好，贵公司是采用定点突变的方式改造酶分子吗？还是采用定向进化的方式？谢谢。...

基本方案与你采用的策略类似，既利用致错PCR构建突变库（库容量可以超过10E6(一百万）。但不包括后续突变库的筛选。
赞一下 回复此楼
5楼2014-09-05 22:39:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

panda73

金虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 屏蔽内容 2014-09-05 14:58:09
本帖内容被屏蔽
2楼2014-09-05 13:23:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panda73

金虫 (小有名气)
如有需要，请联系support@bettermab.com
赞一下 回复此楼
3楼2014-09-05 13:24:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lywachieve

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by panda73 at 2014-09-05 13:23:30
如果愿意，我们公司可以为你提供相关的技术服务，而且收费合理（5000元左右），1-2周，交付符合客户要求的突变库。

您好，贵公司是采用定点突变的方式改造酶分子吗？还是采用定向进化的方式？谢谢。
赞一下(1人) 回复此楼
每天进步多一点
4楼2014-09-05 14:05:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 286分人工智能专业请求调剂愿意跨考！ +4 lemonzzn 2026-03-17 8/400 2026-03-21 22:49 by lemonzzn
[考研] 26考研一志愿中国石油大学(华东)305分求调剂 +6 嘉年新程 2026-03-15 6/300 2026-03-21 17:07 by Dream007008
[考研] 268求调剂 +9 简单点0 2026-03-17 9/450 2026-03-21 15:37 by lature00
[考研] 279求调剂 +5 红衣隐官 2026-03-21 5/250 2026-03-21 14:59 by lature00
[考研] 材料与化工（0856）304求 B区 调剂 +3 邱gl 2026-03-21 3/150 2026-03-21 13:47 by lature00
[考研] 求调剂 +3 白QF 2026-03-21 3/150 2026-03-21 13:12 by zhukairuo
[考研] 083200学硕321分一志愿暨南大学求调剂 +3 innocenceF 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:35 by JourneyLucky
[考研] 材料 336 求调剂 +3 An@. 2026-03-18 4/200 2026-03-21 01:39 by JourneyLucky
[考研] 一志愿重庆大学085700资源与环境专硕，总分308求调剂 +3 墨墨漠 2026-03-18 3/150 2026-03-21 00:39 by JourneyLucky
[考研] 274求调剂 +10 S.H1 2026-03-18 10/500 2026-03-20 23:51 by JourneyLucky
[考研] 321求调剂 +9 何润采123 2026-03-18 11/550 2026-03-20 23:19 by JourneyLucky
[考研] 考研调剂求学校推荐 +3 伯乐29 2026-03-18 5/250 2026-03-20 22:59 by JourneyLucky
[考研] 323求调剂 +3 洼小桶 2026-03-18 3/150 2026-03-20 22:54 by JourneyLucky
[考研] A区线材料学调剂 +5 周周无极 2026-03-20 5/250 2026-03-20 21:33 by laoshidan
[考研] 0817 化学工程 299分求调剂 有科研经历 有二区文章 +22 rare12345 2026-03-18 22/1100 2026-03-20 20:39 by zhukairuo
[考研] 289求调剂 +6 怀瑾握瑜l 2026-03-20 6/300 2026-03-20 20:30 by 学员8dgXkO
[考博] 申博26年 +3 八6八68 2026-03-19 3/150 2026-03-19 19:43 by nxgogo
[考研] 290求调剂 +3 p asserby. 2026-03-15 4/200 2026-03-17 16:35 by wangkm
[考研] 333求调剂 +3 文思客 2026-03-16 7/350 2026-03-16 18:21 by 文思客
[考研] 0856专硕279求调剂 +5 加油加油！? 2026-03-15 5/250 2026-03-15 11:58 by 2020015
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭