应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 急 分子克隆遇到问题
51/1返回列表
查看: 2425  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

lywachieve

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 急 分子克隆遇到问题

目前一直在做酶分子的定向进化，但是所做分子克隆部分三个月以来一直不成功；因为这是后续试验基础，恳请大家提出宝贵建议，不胜感激；
本人是应用易错PCR方法改造目的基因；即通过改变PCR体系中各组分的比例如Mg离子浓度，添加Mn离子等，模拟自然进化引入错配碱基，从而改变酶的性状。而在此之前已有公司合成载体PET-24a-atsA-N-6His;（即公司已经把目的片段全长与载体连接完成）；而导师的计划是先改造目的片段的控制水解酶性状的一部分（即目的片段部分长度）；由公司设计针对此部分片段的引物；本人进行易错PCR，再对此PCR片段和载体进行双酶切，酶切位点单一，均为粘性末端（NEB公司内切酶；载体和片段同步双酶切，37度双酶同时切2h），酶切后电泳验证；载体胶回收纯化（此时载体已去除了待突变片段，但仍含有控制该酶其他性状的基因）；目的片段用PCR产物回收试剂盒回收纯化（只切掉56bp）；纯化均采用捷瑞试剂盒；载体切8ug回收十几ng/ul约20ul量；目的片段且2ug;回收约20-30ng/ul约30ul量；连接时用TakaRa 的T4 ；比例从1:3-1:10都试过；10ul-20ul化转入商品化DH5a  都无菌落产生，（抗生素抗性无问题，也没有失效）；加倍T4量后有少量菌落，但菌落PCR均无目的条带出现；（菌落PCR体系无问题，以用商品化原质粒转化后挑取单克隆验证有目的条带。）
为探究原因，做以下实验：
  1.针对待突变部分基因做常规PCR，测序示无突变，再依上述方法酶切连接，转化，仍未有菌落长出；
  2.突变目的片段后胶回收纯化，PMD-T19连接测序；刮取平板，混提质粒，双酶切目的片段，以之前切取纯化后的目的片段对照，胶回收纯化目的片段；再与双酶切后载体T4连接，转化商品化DH5a；仍无菌落长出；(连T载体测序示突变未导致酶切位点改变)。

另外，因相关文献鲜有报道只突变目的片段一部分再重组,而往往是针对目的片段全长突变；不知这一点对分子克隆有无影响？
可请各位专家予以指导，不胜感激。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
每天进步多一点
1楼 2014-09-05 09:49:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lywachieve

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by panda73 at 2014-09-05 13:23:30
如果愿意，我们公司可以为你提供相关的技术服务，而且收费合理（5000元左右），1-2周，交付符合客户要求的突变库。

您好，贵公司是采用定点突变的方式改造酶分子吗？还是采用定向进化的方式？谢谢。
赞一下(1人) 回复此楼
每天进步多一点
4楼2014-09-05 14:05:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

panda73

金虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 屏蔽内容 2014-09-05 14:58:09
本帖内容被屏蔽
2楼2014-09-05 13:23:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panda73

金虫 (小有名气)
如有需要，请联系support@bettermab.com
赞一下 回复此楼
3楼2014-09-05 13:24:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lywachieve: 金币+2, ★有帮助, 感谢提供另一种途径 2014-09-06 08:35:54
引用回帖:
4楼: Originally posted by lywachieve at 2014-09-05 14:05:57
您好，贵公司是采用定点突变的方式改造酶分子吗？还是采用定向进化的方式？谢谢。...

基本方案与你采用的策略类似，既利用致错PCR构建突变库（库容量可以超过10E6(一百万）。但不包括后续突变库的筛选。
赞一下 回复此楼
5楼2014-09-05 22:39:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 302求调剂 +9 负心者当诛 2026-03-11 9/450 2026-03-17 17:13 by ruiyingmiao
[考研] 332求调剂 +6 Zz版 2026-03-13 6/300 2026-03-17 17:03 by ruiyingmiao
[考研] 274求调剂0856材料化工 +13 z2839474511 2026-03-11 14/700 2026-03-17 16:51 by share_joy
[考研] 梁成伟老师课题组欢迎你的加入 +8 一鸭鸭哟 2026-03-14 10/500 2026-03-17 15:07 by 一鸭鸭哟
[基金申请] 国自科面上基金字体 +6 iwuli 2026-03-12 7/350 2026-03-16 21:18 by sculhf
[考研] 318求调剂 +3 Yanyali 2026-03-15 3/150 2026-03-16 16:41 by houyaoxu
[考研] 283求调剂 +10 小楼。 2026-03-12 14/700 2026-03-16 16:08 by 13811244083
[考研] 一志愿华中师范071000，325求调剂 +6 RuitingC 2026-03-12 6/300 2026-03-16 14:50 by 可淡不可忘
[考研] 材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐 +7 Ncdx123456 2026-03-13 8/400 2026-03-16 12:15 by karry wen
[考研] 中科大材料与化工319求调剂 +3 孟鑫材料 2026-03-14 3/150 2026-03-14 20:10 by ms629
[考研] 本科南京大学一志愿川大药学327 +3 麦田耕者 2026-03-14 3/150 2026-03-14 20:04 by 外星文明
[考研] 255求调剂 +3 李嘉慧， 2026-03-12 4/200 2026-03-14 16:58 by 有只狸奴
[考研] 复试调剂 +3 呼呼？~+123456 2026-03-14 3/150 2026-03-14 16:53 by WTUChen
[考研] 材料080500调剂求收留 +3 一颗meteor 2026-03-13 3/150 2026-03-14 10:54 by peike
[考研] 331求调剂（0703有机化学 +5 ZY-05 2026-03-13 6/300 2026-03-14 10:51 by Jy?
[考研] 308 085701 四六级已过求调剂 +7 温乔乔乔乔 2026-03-12 14/700 2026-03-14 10:49 by JourneyLucky
[基金申请] 有必要更换申报口吗 20+3 fannyamoy 2026-03-11 3/150 2026-03-14 00:52 by zhanghaozhu
[考研] 0703，333分求调剂 一志愿郑州大学-物理化学 +3 李魔女斗篷 2026-03-11 3/150 2026-03-13 22:24 by JourneyLucky
[考研] 311求调剂 +3 冬十三 2026-03-13 3/150 2026-03-13 20:41 by JourneyLucky
[考研] 工科278分求调剂 +5 周慢热啊 2026-03-12 7/350 2026-03-13 15:49 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭