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lywachieve至尊木虫 (著名写手)
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急 分子克隆遇到问题
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目前一直在做酶分子的定向进化，但是所做分子克隆部分三个月以来一直不成功；因为这是后续试验基础，恳请大家提出宝贵建议，不胜感激； 本人是应用易错PCR方法改造目的基因；即通过改变PCR体系中各组分的比例如Mg离子浓度，添加Mn离子等，模拟自然进化引入错配碱基，从而改变酶的性状。而在此之前已有公司合成载体PET-24a-atsA-N-6His;（即公司已经把目的片段全长与载体连接完成）；而导师的计划是先改造目的片段的控制水解酶性状的一部分（即目的片段部分长度）；由公司设计针对此部分片段的引物；本人进行易错PCR，再对此PCR片段和载体进行双酶切，酶切位点单一，均为粘性末端（NEB公司内切酶；载体和片段同步双酶切，37度双酶同时切2h），酶切后电泳验证；载体胶回收纯化（此时载体已去除了待突变片段，但仍含有控制该酶其他性状的基因）；目的片段用PCR产物回收试剂盒回收纯化（只切掉56bp）；纯化均采用捷瑞试剂盒；载体切8ug回收十几ng/ul约20ul量；目的片段且2ug;回收约20-30ng/ul约30ul量；连接时用TakaRa 的T4 ；比例从1:3-1:10都试过；10ul-20ul化转入商品化DH5a 都无菌落产生，（抗生素抗性无问题，也没有失效）；加倍T4量后有少量菌落，但菌落PCR均无目的条带出现；（菌落PCR体系无问题，以用商品化原质粒转化后挑取单克隆验证有目的条带。） 为探究原因，做以下实验： 1.针对待突变部分基因做常规PCR，测序示无突变，再依上述方法酶切连接，转化，仍未有菌落长出； 2.突变目的片段后胶回收纯化，PMD-T19连接测序；刮取平板，混提质粒，双酶切目的片段，以之前切取纯化后的目的片段对照，胶回收纯化目的片段；再与双酶切后载体T4连接，转化商品化DH5a；仍无菌落长出；(连T载体测序示突变未导致酶切位点改变)。 另外，因相关文献鲜有报道只突变目的片段一部分再重组,而往往是针对目的片段全长突变；不知这一点对分子克隆有无影响？ 可请各位专家予以指导，不胜感激。 |
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