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zans2009

铜虫 (初入文坛)

[求助] 用鉴定真菌的通用引物its1、its4，为何扩出目的条带呢 已有3人参与

刚筛选出4种真菌，用通用引物做pcr，从电泳图上看，请问我出了哪些问题呢？
1号出现弥散条带，2号条带范围从400bp到550bp间，3、4号出现了不止一个条带，而且最大的达到5000bp，我弄错了什么吗？没分离完全？还是PCR出了问题？

反应温度如下：
94℃      3min

94℃       30s
55℃      45s
72℃      1min
35cycle

72℃      3min

通用引物
ITSl(5’一TCC GTA GGT GAA CCT GCGG-3’)
ITS4(5’一TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC一3’)

四种DNA浓度分别为15ng/ul、31ng/ul、 168ng/ul、 27ng/ul、
260/280分别为1.77、1.63、1.82、1.74。

谢谢了

用鉴定真菌的通用引物its1、its4，为何扩出目的条带呢
2014-8-26 _副本.jpg
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1楼 2014-08-27 10:12:50
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zans2009

铜虫 (初入文坛)
对了，25ul体系，PCR时引物加1ul、DNA加3ul。
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2楼2014-08-27 10:19:16
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zans2009(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-27 19:14:35
引用回帖:
2楼: Originally posted by zans2009 at 2014-08-27 10:19:16
对了，25ul体系，PCR时引物加1ul、DNA加3ul。

DNA模板太多了,可以稀释20-50倍加1ul！另外不知道楼主的目的是什么，只从电泳图看，1号2号P的挺好，不存在弥散条带，胶回收下就好了，没问题。3号4号条带多说明你的引物出现了非特异性扩增，毕竟你用的通用引物这个很正常，只要有你想要的目的片断就可以了，胶回收就可以了！
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3楼2014-08-27 11:03:15
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zans2009

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huyan0817 at 2014-08-27 11:03:15
DNA模板太多了,可以稀释20-50倍加1ul！另外不知道楼主的目的是什么，只从电泳图看，1号2号P的挺好，不存在弥散条带，胶回收下就好了，没问题。3号4号条带多说明你的引物出现了非特异性扩增，毕竟你用的通用引物这个 ...

我筛出4种真菌，做PCR是打算胶回收后测序做鉴定的，用its通用引物P出真菌的its2序列应该是500bp左右吧。现在3、4号出现5kb的条带，而且500bp处的条带不如1、2号那么明显，心里没谱了
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4楼2014-08-27 11:46:22
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by zans2009 at 2014-08-27 11:46:22
我筛出4种真菌，做PCR是打算胶回收后测序做鉴定的，用its通用引物P出真菌的its2序列应该是500bp左右吧。现在3、4号出现5kb的条带，而且500bp处的条带不如1、2号那么明显，心里没谱了...

楼主可以尝试把退火温度再降几度,模板稀释20-50倍,再做PCR!
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5楼2014-08-27 12:59:38
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zans2009

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by huyan0817 at 2014-08-27 12:59:38
楼主可以尝试把退火温度再降几度,模板稀释20-50倍,再做PCR!...

好的，我明天试试看。
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6楼2014-08-27 16:39:50
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zans2009(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-27 19:14:46
DNA加1即可，通用引物ITS1和ITS4用于大多数担子菌和子囊菌。基因组这么大，即便是通用引物不一定特异性很高，都能扩增出来。重新PCR还是如此的话，可以换一下引物。
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学习使你立于不败之地
7楼2014-08-27 17:14:36
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angelyou

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zans2009(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-27 19:14:59
1号2号应该没啥问题，一般ITS都是500多600多的大小，后面那两个估计是因为种的原因有非特异性的结合，可以切五六百的带回收，或者根据真菌种类考虑用别的方法鉴定
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8楼2014-08-27 18:36:53
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zans2009

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-08-27 17:14:36
DNA加1即可，通用引物ITS1和ITS4用于大多数担子菌和子囊菌。基因组这么大，即便是通用引物不一定特异性很高，都能扩增出来。重新PCR还是如此的话，可以换一下引物。

因为只知道是某种真菌，但不知道是哪种真菌，如果更换引物的话，前辈建议用哪种引物呢？
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9楼2014-08-27 19:32:01
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zans2009

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by angelyou at 2014-08-27 18:36:53
1号2号应该没啥问题，一般ITS都是500多600多的大小，后面那两个估计是因为种的原因有非特异性的结合，可以切五六百的带回收，或者根据真菌种类考虑用别的方法鉴定

因为是第一次做这方面的工作，有些还不是很明白。
电泳出现无单一的条带，不知道是否是因为没有纯化好。
在真菌鉴定中，用ITS做PCR出现5kb的非特异条带的情况普遍吗？貌似文献中没有提及非特异条带的问题。
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10楼2014-08-27 19:39:31
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