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zans2009

铜虫 (初入文坛)

[求助] 用鉴定真菌的通用引物its1、its4,为何扩出目的条带呢 已有3人参与

刚筛选出4种真菌,用通用引物做pcr,从电泳图上看,请问我出了哪些问题呢?
1号出现弥散条带,2号条带范围从400bp到550bp间,3、4号出现了不止一个条带,而且最大的达到5000bp,我弄错了什么吗?没分离完全?还是PCR出了问题?

反应温度如下:
94℃      3min

94℃       30s
55℃      45s
72℃      1min
35cycle

72℃      3min

通用引物
ITSl(5’一TCC GTA GGT GAA CCT GCGG-3’)
ITS4(5’一TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC一3’)

四种DNA浓度分别为15ng/ul、31ng/ul、 168ng/ul、 27ng/ul、
260/280分别为1.77、1.63、1.82、1.74。

谢谢了

用鉴定真菌的通用引物its1、its4,为何扩出目的条带呢
2014-8-26 _副本.jpg
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by zans2009 at 2014-08-27 11:46:22
我筛出4种真菌,做PCR是打算胶回收后测序做鉴定的,用its通用引物P出真菌的its2序列应该是500bp左右吧。现在3、4号出现5kb的条带,而且500bp处的条带不如1、2号那么明显,心里没谱了...

楼主可以尝试把退火温度再降几度,模板稀释20-50倍,再做PCR!
5楼2014-08-27 12:59:38
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zans2009

铜虫 (初入文坛)

对了,25ul体系,PCR时引物加1ul、DNA加3ul。
2楼2014-08-27 10:19:16
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zans2009(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-27 19:14:35
引用回帖:
2楼: Originally posted by zans2009 at 2014-08-27 10:19:16
对了,25ul体系,PCR时引物加1ul、DNA加3ul。

DNA模板太多了,可以稀释20-50倍加1ul!另外不知道楼主的目的是什么,只从电泳图看,1号2号P的挺好,不存在弥散条带,胶回收下就好了,没问题。3号4号条带多说明你的引物出现了非特异性扩增,毕竟你用的通用引物这个很正常,只要有你想要的目的片断就可以了,胶回收就可以了!
3楼2014-08-27 11:03:15
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zans2009

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by huyan0817 at 2014-08-27 11:03:15
DNA模板太多了,可以稀释20-50倍加1ul!另外不知道楼主的目的是什么,只从电泳图看,1号2号P的挺好,不存在弥散条带,胶回收下就好了,没问题。3号4号条带多说明你的引物出现了非特异性扩增,毕竟你用的通用引物这个 ...

我筛出4种真菌,做PCR是打算胶回收后测序做鉴定的,用its通用引物P出真菌的its2序列应该是500bp左右吧。现在3、4号出现5kb的条带,而且500bp处的条带不如1、2号那么明显,心里没谱了
4楼2014-08-27 11:46:22
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