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andyzhengwp金虫 (小有名气)
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关于in-fusion PCR问题 已有4人参与
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我现在要将一个片段无缝的插入到一个质粒的特定位点中，Clontech的In-Fusion试剂盒已经买了，但是发现它需要将质粒线性化，如果酶切线性化的话将不是无缝连接，会有几个碱基多出来，质粒有太大无法pcr方法线性化。 求助：1，有没有好的方法师质粒不加碱基线性化（酶切之后再PCR，肯定会在以前质粒的基础上多出几个碱基来的）？ 2.或者有什么好的方法直接实现将一个片段无缝的插入到一个质粒的特定位点中？ |
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ksws0465326
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andyzhengwp: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-20 09:07:10
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刚才看了下MAX的说明书，你的反应体系是怎样的？还有反应条件？还有你的质粒的浓度怎样？根据说明书，再加上我个人感觉，反应体系中，如果是50μl体系，质粒的终浓度最好不要超过1ng/50μl，其次，反应条件，你的退火，延伸温度及相应时间怎么设定的？如果你退火温度是55度5s，也可以尝试下将温度降到50试试，这两天我做一个GXL就是，推荐60度降到50度才出来的，再有延伸温度如果先前微72度，可以降到68度 按1kb/min试一试，再有就是循环数，说明书推荐30-35，也可以增大到40尝试一下。纯属个人意见，我也在学习中。。呵呵，仅供参考。祝楼主早日成功！  |
6楼2014-08-19 21:35:11
xiaoweiwei121
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经常用这个infusion kit 如果引物没问题，成功率没得说，一般没失过手，平板上阳性克隆90%以上。 不过我的载体4k多，设计了引物可以直接扩出来，没尝试过酶切的方法 楼主还是像楼上说的改善一下条件，扩一下吧 因为这个设计引物太重要了，曾经犯了个错误，某个引物的重复序列后边多了几个碱基，就死活做不出来了 问了他们公司的技术支持，才知道的原因 |
7楼2014-08-20 00:55:05
2楼2014-08-19 12:40:35
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按正常情况的话，如果序列相同的质粒和线性化条带跑电泳，应该差不多，质粒会稍微慢一点儿，但没做过对比，不清楚，呵呵，一般我跑都是1%的胶100v跑40－50分钟。。5000的marker可以分得很清。还有，单跑质粒的时候有可能会出现两倍或三倍于质粒bp的条带，跟人觉得这也有可能是质粒重叠造成的。 |
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andyzhengwp10楼2014-08-20 11:19:16
