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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2026级博士研究生招生报考通知(长期有效)
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-20 11:19:16
按正常情况的话,如果序列相同的质粒和线性化条带跑电泳,应该差不多,质粒会稍微慢一点儿,但没做过对比,不清楚,呵呵,一般我跑都是1%的胶100v跑40-50分钟。。5000的marker可以分得很清。还有,单跑质粒的时候 ...

哦,这个我知道,单质粒跑胶会有三条带,因为环状质粒有不同的构象。再问一个问题哈,你做的用一对还是用一个引物啊?
每天坚持一点点,终会成功!相信自己
11楼2014-08-20 12:20:46
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-20 11:19:16
按正常情况的话,如果序列相同的质粒和线性化条带跑电泳,应该差不多,质粒会稍微慢一点儿,但没做过对比,不清楚,呵呵,一般我跑都是1%的胶100v跑40-50分钟。。5000的marker可以分得很清。还有,单跑质粒的时候 ...

你做的用一对还是用一个引物啊?
每天坚持一点点,终会成功!相信自己
12楼2014-08-20 15:05:46
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-20 11:19:16
按正常情况的话,如果序列相同的质粒和线性化条带跑电泳,应该差不多,质粒会稍微慢一点儿,但没做过对比,不清楚,呵呵,一般我跑都是1%的胶100v跑40-50分钟。。5000的marker可以分得很清。还有,单跑质粒的时候 ...

这是跑的图,左到右一次是8k marker,对照质粒,线性化PCR产物。我怎么看都看不懂,是不是没有P出来啊?
关于in-fusion PCR问题
M8O$G{0%V%8(8A3@QTRW}G1.jpg

每天坚持一点点,终会成功!相信自己
13楼2014-08-20 21:14:01
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sunshine436

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
andyzhengwp: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-21 15:26:48
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-09-20 23:07:26
HD-infusion很好用,你把载体双酶切,回收,片段PCR,设计引物时,按照说明书是片段和载体重合15个碱基,载体两个酶切位点的粘性末端多出来的几个碱基也算在15个里面,用kit,50°15min即可转化。

[ 发自小木虫客户端 ]
14楼2014-08-20 21:45:21
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by andyzhengwp at 2014-08-20 09:11:54
谢谢支持,你用的kit是什么公司的啊?PCR线性化不会出现碱基缺失或者其他的问题吧?你做的用一对还是用一个引物啊?...

和你一个公司的 clontech
没有出现过这个问题
一对引物
15楼2014-08-20 23:16:03
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xiaoweiwei121

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引用回帖:
13楼: Originally posted by andyzhengwp at 2014-08-20 21:14:01
这是跑的图,左到右一次是8k marker,对照质粒,线性化PCR产物。我怎么看都看不懂,是不是没有P出来啊?

M8O$G{0%V%8(8A3@QTRW}G1.jpg
...

感觉好像p的不好
16楼2014-08-20 23:17:35
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
andyzhengwp(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-08-21 15:32:08
引用回帖:
13楼: Originally posted by andyzhengwp at 2014-08-20 21:14:01
这是跑的图,左到右一次是8k marker,对照质粒,线性化PCR产物。我怎么看都看不懂,是不是没有P出来啊?

M8O$G{0%V%8(8A3@QTRW}G1.jpg
...

我的实验是这样的,一共设计两对引物,载体一对(R1-F1),目的基因一对(F2-R2),目的:将目的基因插入载体中。我将每条引物分为A,B两段,用GXL分别扩增载体和目的基因。其中,R1A为基因插入前段载体序列,R1B为Linker序列,目的基因引物F2A序列与R1B相同,F2B为插入基因开始序列,目的基因引物R2A为插入基因末端序列,R2B序列与载体引物F1A序列相同,载体序列F1A与F1B均为插入基因下游载体序列。其中,Linker序列(R1B与F2A)和(R2B与F1A)碱基数为15碱基,分别扩增,鉴定Dpn I处理,切胶回收,然后in-fusion HD enzyme 50度15min,最后导入感受胎。楼主说你的质粒7k+,但是从你的图来看8k marker, 质粒条带有两条,是否进行过单酶切鉴定?还有这次的反应条件是什么?单从结果来看效果不太好,但不说明条件,造成这样的结果不好分析阿
17楼2014-08-21 08:26:06
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)

引用回帖:
17楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-21 08:26:06
我的实验是这样的,一共设计两对引物,载体一对(R1-F1),目的基因一对(F2-R2),目的:将目的基因插入载体中。我将每条引物分为A,B两段,用GXL分别扩增载体和目的基因。其中,R1A为基因插入前段载体序列,R1B ...

我用的您推荐的条件,primerSTAR MAX,50ul体系,50度退火,68度延伸7min,质粒没有做过单酶切。
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18楼2014-08-21 10:21:49
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-21 15:32:27
引用回帖:
18楼: Originally posted by andyzhengwp at 2014-08-21 10:21:49
我用的您推荐的条件,primerSTAR MAX,50ul体系,50度退火,68度延伸7min,质粒没有做过单酶切。...

最好还是单酶切鉴定下,这个质粒到底是不是你要用的。。如果模板本身不对,做什么都没用了不是,呵呵,毕竟MAX不便宜阿,再有,50度退火你做了5s?还是别的?如果是5s,再做个15s试试,或是,用那个体系,作个模板浓度梯度。。。这样高效率的酶,对模板量要求还是比较高的,你买的说明书是中文的还是英文的?里边应该有他们做的各种条件下实验数据吧(基因组,质粒,cDNA,rDNA用量,时间什么的)如果没有再给你份说明书
19楼2014-08-21 14:24:36
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)

引用回帖:
19楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-21 14:24:36
最好还是单酶切鉴定下,这个质粒到底是不是你要用的。。如果模板本身不对,做什么都没用了不是,呵呵,毕竟MAX不便宜阿,再有,50度退火你做了5s?还是别的?如果是5s,再做个15s试试,或是,用那个体系,作个模板 ...

中文的说明书,各种都有实验条件都有,第一次就按里面说的做的,和这次结果跑出来的带是一样的。我想问问这个infusion 可以中间链接几个片段吗?几个片段之间都有接头,和线性化质粒混合到一起可以连上吗?
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20楼2014-08-21 15:26:34
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