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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于in-fusion PCR问题
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-20 11:19:16
按正常情况的话，如果序列相同的质粒和线性化条带跑电泳，应该差不多，质粒会稍微慢一点儿，但没做过对比，不清楚，呵呵，一般我跑都是1%的胶100v跑40－50分钟。。5000的marker可以分得很清。还有，单跑质粒的时候 ...

哦，这个我知道，单质粒跑胶会有三条带，因为环状质粒有不同的构象。再问一个问题哈，你做的用一对还是用一个引物啊？
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11楼2014-08-20 12:20:46
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-20 11:19:16
按正常情况的话，如果序列相同的质粒和线性化条带跑电泳，应该差不多，质粒会稍微慢一点儿，但没做过对比，不清楚，呵呵，一般我跑都是1%的胶100v跑40－50分钟。。5000的marker可以分得很清。还有，单跑质粒的时候 ...

你做的用一对还是用一个引物啊？
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12楼2014-08-20 15:05:46
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-20 11:19:16
按正常情况的话，如果序列相同的质粒和线性化条带跑电泳，应该差不多，质粒会稍微慢一点儿，但没做过对比，不清楚，呵呵，一般我跑都是1%的胶100v跑40－50分钟。。5000的marker可以分得很清。还有，单跑质粒的时候 ...

这是跑的图，左到右一次是8k marker，对照质粒，线性化PCR产物。我怎么看都看不懂，是不是没有P出来啊？
关于in-fusion PCR问题
M8O$G{0%V%8(8A3@QTRW}G1.jpg
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13楼2014-08-20 21:14:01
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sunshine436

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
andyzhengwp: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-21 15:26:48
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-20 23:07:26
HD-infusion很好用，你把载体双酶切，回收，片段PCR，设计引物时，按照说明书是片段和载体重合15个碱基，载体两个酶切位点的粘性末端多出来的几个碱基也算在15个里面，用kit，50°15min即可转化。

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14楼2014-08-20 21:45:21
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by andyzhengwp at 2014-08-20 09:11:54
谢谢支持，你用的kit是什么公司的啊？PCR线性化不会出现碱基缺失或者其他的问题吧？你做的用一对还是用一个引物啊？...

和你一个公司的 clontech
没有出现过这个问题
一对引物
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15楼2014-08-20 23:16:03
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

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引用回帖:
13楼: Originally posted by andyzhengwp at 2014-08-20 21:14:01
这是跑的图，左到右一次是8k marker，对照质粒，线性化PCR产物。我怎么看都看不懂，是不是没有P出来啊？

M8O$G{0%V%8(8A3@QTRW}G1.jpg
...

感觉好像p的不好
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16楼2014-08-20 23:17:35
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
andyzhengwp(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-08-21 15:32:08
引用回帖:
13楼: Originally posted by andyzhengwp at 2014-08-20 21:14:01
这是跑的图，左到右一次是8k marker，对照质粒，线性化PCR产物。我怎么看都看不懂，是不是没有P出来啊？

M8O$G{0%V%8(8A3@QTRW}G1.jpg
...

我的实验是这样的，一共设计两对引物，载体一对（R1－F1），目的基因一对（F2-R2），目的：将目的基因插入载体中。我将每条引物分为A，B两段，用GXL分别扩增载体和目的基因。其中，R1A为基因插入前段载体序列，R1B为Linker序列，目的基因引物F2A序列与R1B相同，F2B为插入基因开始序列，目的基因引物R2A为插入基因末端序列，R2B序列与载体引物F1A序列相同，载体序列F1A与F1B均为插入基因下游载体序列。其中，Linker序列（R1B与F2A）和（R2B与F1A）碱基数为15碱基，分别扩增，鉴定Dpn I处理，切胶回收，然后in－fusion HD enzyme 50度15min，最后导入感受胎。楼主说你的质粒7k＋，但是从你的图来看8k marker， 质粒条带有两条，是否进行过单酶切鉴定？还有这次的反应条件是什么？单从结果来看效果不太好，但不说明条件，造成这样的结果不好分析阿
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17楼2014-08-21 08:26:06
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-21 08:26:06
我的实验是这样的，一共设计两对引物，载体一对（R1－F1），目的基因一对（F2-R2），目的：将目的基因插入载体中。我将每条引物分为A，B两段，用GXL分别扩增载体和目的基因。其中，R1A为基因插入前段载体序列，R1B ...

我用的您推荐的条件，primerSTAR MAX，50ul体系，50度退火，68度延伸7min，质粒没有做过单酶切。
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18楼2014-08-21 10:21:49
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-21 15:32:27
引用回帖:
18楼: Originally posted by andyzhengwp at 2014-08-21 10:21:49
我用的您推荐的条件，primerSTAR MAX，50ul体系，50度退火，68度延伸7min，质粒没有做过单酶切。...

最好还是单酶切鉴定下，这个质粒到底是不是你要用的。。如果模板本身不对，做什么都没用了不是，呵呵，毕竟MAX不便宜阿，再有，50度退火你做了5s？还是别的？如果是5s，再做个15s试试，或是，用那个体系，作个模板浓度梯度。。。这样高效率的酶，对模板量要求还是比较高的，你买的说明书是中文的还是英文的？里边应该有他们做的各种条件下实验数据吧（基因组，质粒，cDNA，rDNA用量，时间什么的）如果没有再给你份说明书
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19楼2014-08-21 14:24:36
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-21 14:24:36
最好还是单酶切鉴定下，这个质粒到底是不是你要用的。。如果模板本身不对，做什么都没用了不是，呵呵，毕竟MAX不便宜阿，再有，50度退火你做了5s？还是别的？如果是5s，再做个15s试试，或是，用那个体系，作个模板 ...

中文的说明书，各种都有实验条件都有，第一次就按里面说的做的，和这次结果跑出来的带是一样的。我想问问这个infusion 可以中间链接几个片段吗？几个片段之间都有接头，和线性化质粒混合到一起可以连上吗？
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20楼2014-08-21 15:26:34
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