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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于in-fusion PCR问题
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)

[求助] 关于in-fusion PCR问题 已有4人参与

我现在要将一个片段无缝的插入到一个质粒的特定位点中，Clontech的In-Fusion试剂盒已经买了，但是发现它需要将质粒线性化，如果酶切线性化的话将不是无缝连接，会有几个碱基多出来，质粒有太大无法pcr方法线性化。
求助：1，有没有好的方法师质粒不加碱基线性化（酶切之后再PCR，肯定会在以前质粒的基础上多出几个碱基来的）？
         2.或者有什么好的方法直接实现将一个片段无缝的插入到一个质粒的特定位点中？
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每天坚持一点点，终会成功！相信自己
1楼 2014-08-19 10:53:45
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-20 11:19:16
按正常情况的话，如果序列相同的质粒和线性化条带跑电泳，应该差不多，质粒会稍微慢一点儿，但没做过对比，不清楚，呵呵，一般我跑都是1%的胶100v跑40－50分钟。。5000的marker可以分得很清。还有，单跑质粒的时候 ...

哦，这个我知道，单质粒跑胶会有三条带，因为环状质粒有不同的构象。再问一个问题哈，你做的用一对还是用一个引物啊？
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11楼2014-08-20 12:20:46
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bio_sci

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-19 12:46:28
andyzhengwp: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-19 14:56:28
酶切线性化，然后用Klenow酶大片段 补平，不过引物设计的时候得注意了
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2楼2014-08-19 12:40:35
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
andyzhengwp: 金币+5 2014-08-19 14:56:35
andyzhengwp: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-19 14:56:46
不知道你用的质粒到底多大，我前些时曾经扩增4k＋的线性质粒，用的primerstar GXL，效果很好，而且用这个扩增，线性DNA末尾不会像Taq那样多出一个A碱基。如果可以的话你可以拿这个试一试扩增你的质粒。
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3楼2014-08-19 13:32:12
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-19 13:32:12
不知道你用的质粒到底多大，我前些时曾经扩增4k＋的线性质粒，用的primerstar GXL，效果很好，而且用这个扩增，线性DNA末尾不会像Taq那样多出一个A碱基。如果可以的话你可以拿这个试一试扩增你的质粒。

我的质粒有7k多，我用的primerstar MAX酶，结果没有扩出来
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4楼2014-08-19 14:52:12
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