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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于in-fusion PCR问题
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)

[求助] 关于in-fusion PCR问题 已有4人参与

我现在要将一个片段无缝的插入到一个质粒的特定位点中，Clontech的In-Fusion试剂盒已经买了，但是发现它需要将质粒线性化，如果酶切线性化的话将不是无缝连接，会有几个碱基多出来，质粒有太大无法pcr方法线性化。
求助：1，有没有好的方法师质粒不加碱基线性化（酶切之后再PCR，肯定会在以前质粒的基础上多出几个碱基来的）？
         2.或者有什么好的方法直接实现将一个片段无缝的插入到一个质粒的特定位点中？
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1楼 2014-08-19 10:53:45
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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andyzhengwp: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-20 09:07:25
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-20 23:06:57
经常用这个infusion kit
如果引物没问题，成功率没得说，一般没失过手，平板上阳性克隆90%以上。
不过我的载体4k多，设计了引物可以直接扩出来，没尝试过酶切的方法
楼主还是像楼上说的改善一下条件，扩一下吧
因为这个设计引物太重要了，曾经犯了个错误，某个引物的重复序列后边多了几个碱基，就死活做不出来了
问了他们公司的技术支持，才知道的原因
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7楼2014-08-20 00:55:05
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-19 12:46:28
andyzhengwp: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-19 14:56:28
酶切线性化，然后用Klenow酶大片段 补平，不过引物设计的时候得注意了
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2楼2014-08-19 12:40:35
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
andyzhengwp: 金币+5 2014-08-19 14:56:35
andyzhengwp: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-19 14:56:46
不知道你用的质粒到底多大，我前些时曾经扩增4k＋的线性质粒，用的primerstar GXL，效果很好，而且用这个扩增，线性DNA末尾不会像Taq那样多出一个A碱基。如果可以的话你可以拿这个试一试扩增你的质粒。
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3楼2014-08-19 13:32:12
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-19 13:32:12
不知道你用的质粒到底多大，我前些时曾经扩增4k＋的线性质粒，用的primerstar GXL，效果很好，而且用这个扩增，线性DNA末尾不会像Taq那样多出一个A碱基。如果可以的话你可以拿这个试一试扩增你的质粒。

我的质粒有7k多，我用的primerstar MAX酶，结果没有扩出来
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4楼2014-08-19 14:52:12
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