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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于in-fusion PCR问题
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)

[求助] 关于in-fusion PCR问题 已有4人参与

我现在要将一个片段无缝的插入到一个质粒的特定位点中，Clontech的In-Fusion试剂盒已经买了，但是发现它需要将质粒线性化，如果酶切线性化的话将不是无缝连接，会有几个碱基多出来，质粒有太大无法pcr方法线性化。
求助：1，有没有好的方法师质粒不加碱基线性化（酶切之后再PCR，肯定会在以前质粒的基础上多出几个碱基来的）？
         2.或者有什么好的方法直接实现将一个片段无缝的插入到一个质粒的特定位点中？
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1楼 2014-08-19 10:53:45
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
andyzhengwp: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-20 09:07:10
引用回帖:
4楼: Originally posted by andyzhengwp at 2014-08-19 14:52:12
我的质粒有7k多，我用的primerstar MAX酶，结果没有扩出来...

刚才看了下MAX的说明书，你的反应体系是怎样的？还有反应条件？还有你的质粒的浓度怎样？根据说明书，再加上我个人感觉，反应体系中，如果是50μl体系，质粒的终浓度最好不要超过1ng/50μl，其次，反应条件，你的退火，延伸温度及相应时间怎么设定的？如果你退火温度是55度5s，也可以尝试下将温度降到50试试，这两天我做一个GXL就是，推荐60度降到50度才出来的，再有延伸温度如果先前微72度，可以降到68度 按1kb/min试一试，再有就是循环数，说明书推荐30-35，也可以增大到40尝试一下。纯属个人意见，我也在学习中。。呵呵，仅供参考。祝楼主早日成功！
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6楼2014-08-19 21:35:11
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-19 12:46:28
andyzhengwp: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-19 14:56:28
酶切线性化，然后用Klenow酶大片段 补平，不过引物设计的时候得注意了
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2楼2014-08-19 12:40:35
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
andyzhengwp: 金币+5 2014-08-19 14:56:35
andyzhengwp: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-19 14:56:46
不知道你用的质粒到底多大，我前些时曾经扩增4k＋的线性质粒，用的primerstar GXL，效果很好，而且用这个扩增，线性DNA末尾不会像Taq那样多出一个A碱基。如果可以的话你可以拿这个试一试扩增你的质粒。
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3楼2014-08-19 13:32:12
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-19 13:32:12
不知道你用的质粒到底多大，我前些时曾经扩增4k＋的线性质粒，用的primerstar GXL，效果很好，而且用这个扩增，线性DNA末尾不会像Taq那样多出一个A碱基。如果可以的话你可以拿这个试一试扩增你的质粒。

我的质粒有7k多，我用的primerstar MAX酶，结果没有扩出来
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每天坚持一点点，终会成功！相信自己
4楼2014-08-19 14:52:12
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