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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » Overlapping PCR,扩增全长片段总是会少,这是什么情况？哪位大神能给我解答一下啊？
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koreyoshitan

金虫 (初入文坛)

[求助] Overlapping PCR,扩增全长片段总是会少,这是什么情况？哪位大神能给我解答一下啊？已有2人参与

我利用overlapping PCR扩增6.4kb的一个片段，设计了四段引物，每一段扩增都是正确的，两段连起来也是正常的，但四段都连接起来的时候就少800多bp,到底是什么原因啊？大神们帮我这个菜鸟解决一下吧！无限感谢！我的体系是模版各1ul ；buffer 2.5ul ;dNTP 2ul ;引物各1ul;水是16.25ul，HIFI酶是0.25ul
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1楼2014-08-16 06:51:04
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koreyoshitan

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wshi85 at 2014-08-17 11:37:33
建议将两段长片段采用重组连接的方式进行拼接！

您的意思是将两个片段用T4连接酶连接起来？中间有重复区就可以是吧？
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5楼2014-08-17 20:43:52
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nl2016

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-16 15:54:55
koreyoshitan: 金币+5, ★有帮助 2014-08-17 20:44:12
你先确定你“每一段扩增都是正确的，两段连起来也是正常的”，如果确定了，那你多挑几个克隆，应该会找到正确的！
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2楼2014-08-16 09:56:31
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koreyoshitan

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by nl2016 at 2014-08-16 09:56:31
你先确定你“每一段扩增都是正确的，两段连起来也是正常的”，如果确定了，那你多挑几个克隆，应该会找到正确的！

已经挑过很多了，做了很多遍，换过RNA，有说是首尾引物的问题，可是扩全长头尾的引物也不能变啊？
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3楼2014-08-16 14:57:28
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wshi85

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
koreyoshitan: 金币+5, ★有帮助 2014-08-17 20:44:21
建议将两段长片段采用重组连接的方式进行拼接！
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很久没在虫虫上漂游了，觉得回归虫虫！
4楼2014-08-17 11:37:33
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