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koreyoshitan

金虫 (初入文坛)

[求助] Overlapping PCR,扩增全长片段总是会少,这是什么情况?哪位大神能给我解答一下啊? 已有2人参与

我利用overlapping PCR扩增6.4kb的一个片段,设计了四段引物,每一段扩增都是正确的,两段连起来也是正常的,但四段都连接起来的时候就少800多bp,到底是什么原因啊?大神们帮我这个菜鸟解决一下吧!无限感谢!我的体系是模版各1ul ;buffer 2.5ul ;dNTP 2ul ;引物各1ul;水是16.25ul,HIFI酶是0.25ul
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koreyoshitan

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by wshi85 at 2014-08-17 11:37:33
建议将两段长片段采用重组连接的方式进行拼接!

您的意思是将两个片段用T4连接酶连接起来?中间有重复区就可以是吧?
5楼2014-08-17 20:43:52
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nl2016

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-08-16 15:54:55
koreyoshitan: 金币+5, 有帮助 2014-08-17 20:44:12
你先确定你“每一段扩增都是正确的,两段连起来也是正常的”,如果确定了,那你多挑几个克隆,应该会找到正确的!
2楼2014-08-16 09:56:31
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koreyoshitan

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by nl2016 at 2014-08-16 09:56:31
你先确定你“每一段扩增都是正确的,两段连起来也是正常的”,如果确定了,那你多挑几个克隆,应该会找到正确的!

已经挑过很多了,做了很多遍,换过RNA,有说是首尾引物的问题,可是扩全长头尾的引物也不能变啊?
3楼2014-08-16 14:57:28
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wshi85

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
koreyoshitan: 金币+5, 有帮助 2014-08-17 20:44:21
建议将两段长片段采用重组连接的方式进行拼接!
很久没在虫虫上漂游了,觉得回归虫虫!
4楼2014-08-17 11:37:33
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