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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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zhou325912

铜虫 (小有名气)

[求助] 融合产物作为模板P不出来,求大神指点!!! 已有2人参与

我做的是四个片段融合,首先PCR扩增出目的基因,然后将前两个基因和后两个基因分别融合,然后胶回收获得大小一致的融合片段,又将这两个融合片段融合在一起,跑胶验证片段大小是对的,然后胶回收,以最终的胶回收融合产物为模板PCR,P出来的大小应该是2700bp左右,可是P了几次总是在750bp左右,P不出来条带。分析不出来原因,有高人做过类似的吗?这个该如何解决啊~~~·
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhou325912: 金币+2 2014-05-29 12:17:47
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-29 13:00:56
overlapping PCR,把你最终胶回收的两个片段跑个胶,看一下浓度,摸索下两个的比例,还有你使用的引物,检查是否有问题?
2楼2014-05-28 15:35:47
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zhou325912

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by smdsfy at 2014-05-28 15:35:47
overlapping PCR,把你最终胶回收的两个片段跑个胶,看一下浓度,摸索下两个的比例,还有你使用的引物,检查是否有问题?

我用nanodrop测了下浓度,一共回收了两管,一个30ng/ul左右,另一个十几ng,然后50ul体系都是加的1ul模板,最终都没有条带,是不是融合片段本身就不好P.还是里面的杂带太多了,还是其他原因?
3楼2014-05-28 18:30:35
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zhou325912

铜虫 (小有名气)

有没有人啊,能不能帮忙分析一下啊~~~~!!!!!!!!
4楼2014-05-28 20:58:04
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

★ ★ ★
zhou325912(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-05-29 13:05:24
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhou325912 at 2014-05-28 18:30:35
我用nanodrop测了下浓度,一共回收了两管,一个30ng/ul左右,另一个十几ng,然后50ul体系都是加的1ul模板,最终都没有条带,是不是融合片段本身就不好P.还是里面的杂带太多了,还是其他原因?...

那个测得浓度不一定准,最好跑胶看一下,不要偷懒,试着把模板的量加大,一般PCR主要在于模板与引物,还有尽量使用高保真的酶,开始试的时候用小体系(如:10ul),至于镁浓度离子,如果有精力可以去摸索一下,意见仅供参考 啊!这个是不太好做,也可以去查考融合PCR相关的文献,多点耐心加细心吧,祝你成功!
5楼2014-05-29 09:56:12
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zhou325912

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by smdsfy at 2014-05-29 09:56:12
那个测得浓度不一定准,最好跑胶看一下,不要偷懒,试着把模板的量加大,一般PCR主要在于模板与引物,还有尽量使用高保真的酶,开始试的时候用小体系(如:10ul),至于镁浓度离子,如果有精力可以去摸索一下,意见仅 ...

谢谢,正在努力中,还是先摸索着看看
6楼2014-05-29 12:18:15
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匿名

用户注销 (初入文坛)

本帖仅楼主可见
7楼2016-10-18 11:34:35
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缘虫彦

新虫 (初入文坛)

西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2018-07-24 21:38:12
我也是,跟你一样做融合pcr,4段融合,胶回收之后的产物再做2次pcr就没条带了,不过我的片段较长6k,你的解决了吗?求经验。
8楼2018-05-25 00:12:42
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最亮的星lala

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 缘虫彦 at 2018-05-25 00:12:42
我也是,跟你一样做融合pcr,4段融合,胶回收之后的产物再做2次pcr就没条带了,不过我的片段较长6k,你的解决了吗?求经验。

请问你P出来了吗?求经验,我的片段长度7kb左右,四片段融合,用的primestar酶,以切胶回收产物为模板一直没扩出来。

发自小木虫Android客户端
9楼2018-07-24 20:24:25
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xuyuzhi

新虫 (正式写手)

一道生物支持你
17343151072目前在一道生物,常联系
10楼2018-07-26 16:49:05
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