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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 融合产物作为模板P不出来，求大神指点！！！
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zhou325912

铜虫 (小有名气)

[求助] 融合产物作为模板P不出来，求大神指点！！！ 已有2人参与

我做的是四个片段融合，首先PCR扩增出目的基因，然后将前两个基因和后两个基因分别融合，然后胶回收获得大小一致的融合片段，又将这两个融合片段融合在一起，跑胶验证片段大小是对的，然后胶回收，以最终的胶回收融合产物为模板PCR，P出来的大小应该是2700bp左右，可是P了几次总是在750bp左右，P不出来条带。分析不出来原因，有高人做过类似的吗？这个该如何解决啊~~~·
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1楼 2014-05-28 13:04:43
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhou325912: 金币+2 2014-05-29 12:17:47
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-29 13:00:56
overlapping PCR，把你最终胶回收的两个片段跑个胶，看一下浓度，摸索下两个的比例，还有你使用的引物，检查是否有问题？
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2楼2014-05-28 15:35:47
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zhou325912

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by smdsfy at 2014-05-28 15:35:47
overlapping PCR，把你最终胶回收的两个片段跑个胶，看一下浓度，摸索下两个的比例，还有你使用的引物，检查是否有问题？

我用nanodrop测了下浓度，一共回收了两管，一个30ng/ul左右，另一个十几ng，然后50ul体系都是加的1ul模板，最终都没有条带，是不是融合片段本身就不好P.还是里面的杂带太多了，还是其他原因?
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3楼2014-05-28 18:30:35
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zhou325912

铜虫 (小有名气)
有没有人啊，能不能帮忙分析一下啊~~~~！！！！！！！！
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4楼2014-05-28 20:58:04
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smdsfy

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
zhou325912(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-05-29 13:05:24
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhou325912 at 2014-05-28 18:30:35
我用nanodrop测了下浓度，一共回收了两管，一个30ng/ul左右，另一个十几ng，然后50ul体系都是加的1ul模板，最终都没有条带，是不是融合片段本身就不好P.还是里面的杂带太多了，还是其他原因?...

那个测得浓度不一定准，最好跑胶看一下，不要偷懒，试着把模板的量加大，一般PCR主要在于模板与引物，还有尽量使用高保真的酶，开始试的时候用小体系(如：10ul),至于镁浓度离子，如果有精力可以去摸索一下，意见仅供参考 啊！这个是不太好做，也可以去查考融合PCR相关的文献，多点耐心加细心吧，祝你成功!
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5楼2014-05-29 09:56:12
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zhou325912

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by smdsfy at 2014-05-29 09:56:12
那个测得浓度不一定准，最好跑胶看一下，不要偷懒，试着把模板的量加大，一般PCR主要在于模板与引物，还有尽量使用高保真的酶，开始试的时候用小体系(如：10ul),至于镁浓度离子，如果有精力可以去摸索一下，意见仅 ...

谢谢，正在努力中，还是先摸索着看看
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6楼2014-05-29 12:18:15
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匿名

用户注销 (初入文坛)
本帖仅楼主可见
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7楼2016-10-18 11:34:35
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缘虫彦

新虫 (初入文坛)
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2018-07-24 21:38:12
我也是，跟你一样做融合pcr，4段融合，胶回收之后的产物再做2次pcr就没条带了，不过我的片段较长6k，你的解决了吗？求经验。
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8楼2018-05-25 00:12:42
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最亮的星lala

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 缘虫彦 at 2018-05-25 00:12:42
我也是，跟你一样做融合pcr，4段融合，胶回收之后的产物再做2次pcr就没条带了，不过我的片段较长6k，你的解决了吗？求经验。

请问你P出来了吗？求经验，我的片段长度7kb左右，四片段融合，用的primestar酶，以切胶回收产物为模板一直没扩出来。

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9楼2018-07-24 20:24:25
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xuyuzhi

新虫 (正式写手)
一道生物支持你
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17343151072目前在一道生物，常联系
10楼2018-07-26 16:49:05
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