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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 半定量实验 什么都没有 怎么回事 求分析？？？ 切切
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学术问题

银虫 (小有名气)

[求助] 半定量实验 什么都没有 怎么回事 求分析？？？ 切切

我现在做荧光定量  老实说先让做个半定量实验  可是我的半定量跑胶结果怎么就什么都没有呢  目的条带 在250bp左右  内参结果是有的 很亮！我该怎么办呢？下面是胶图片  求大神指点！！  其中第一个是对照组  第二个是实验组  我的基因在实验组中应该都是上调的，（倒数第二个是下调的，貌似就出来一个）可是怎么都没有呢？？我的PCR退火温度是55度啊，程序是：94预变性，(94度 30s，55度 30s，72度 15s) 30个循环，最后72度 2min 。哪里有问题呢？
半定量实验 什么都没有 怎么回事  求分析？？？ 切切
十三个基因 CK (1234...13,14)swzx 2013-07-24 21hr 13min.jpg


半定量实验 什么都没有 怎么回事  求分析？？？ 切切-1
十三个基因 CU (1234...13,14)swzx 2013-07-24 21hr 33min.jpg

[ Last edited by 学术问题 on 2013-7-25 at 10:35 ]
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微生物小硕
1楼 2013-07-25 10:32:45
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biomed_fanyi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-25 12:50:22
觉得 PCR没有跑出来。

你的内参模板用的是什么？ 质粒？

样品模板是什么？ Genomic DNA?
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2楼2013-07-25 11:10:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-25 12:50:29
引物特异性怎么样？拿基因组DNA能P出来吗？退火温度做优化了吗？
赞一下 回复此楼
3楼2013-07-25 12:27:13
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学术问题

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biomed_fanyi at 2013-07-25 11:10:37
觉得 PCR没有跑出来。

你的内参模板用的是什么？ 质粒？

样品模板是什么？ Genomic DNA?

样品模板是 cDNA  内参是 肌动蛋白
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微生物小硕
4楼2013-07-25 14:51:01
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学术问题

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-25 12:27:13
引物特异性怎么样？拿基因组DNA能P出来吗？退火温度做优化了吗？

怎样检测引物特异性啊 ? 我的模板是cDNA
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微生物小硕
5楼2013-07-25 14:52:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 学术问题 at 2013-07-25 14:52:25
怎样检测引物特异性啊 ? 我的模板是cDNA...

引物需要blast，看是否只与单一的模板结合。cDNA为模板P出内参不奇怪，如果你的目的基因的mRNA量很低，可能会P不出来的。你可以试试用不同量的cDNA来P。引物的退火温度最好优化。
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6楼2013-07-26 00:46:01
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biomed_fanyi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 学术问题 at 2013-07-25 14:51:01
样品模板是 cDNA  内参是 肌动蛋白...

内参和你pcr的不是一个基因？ 那么就不能说明你pcr系统work了
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7楼2013-07-26 05:39:56
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学术问题

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 00:46:01
引物需要blast，看是否只与单一的模板结合。cDNA为模板P出内参不奇怪，如果你的目的基因的mRNA量很低，可能会P不出来的。你可以试试用不同量的cDNA来P。引物的退火温度最好优化。...

谢谢你了啊！！
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微生物小硕
8楼2013-07-26 08:26:50
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