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zhou325912

铜虫 (小有名气)

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[求助] 融合产物作为模板P不出来，求大神指点！！！已有2人参与

我做的是四个片段融合，首先PCR扩增出目的基因，然后将前两个基因和后两个基因分别融合，然后胶回收获得大小一致的融合片段，又将这两个融合片段融合在一起，跑胶验证片段大小是对的，然后胶回收，以最终的胶回收融合产物为模板PCR，P出来的大小应该是2700bp左右，可是P了几次总是在750bp左右，P不出来条带。分析不出来原因，有高人做过类似的吗？这个该如何解决啊~~~·

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1楼 2014-05-28 13:04:43

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smdsfy

铜虫 (小有名气)

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★ ★ ★
zhou325912(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-05-29 13:05:24

引用回帖:

3楼: Originally posted by zhou325912 at 2014-05-28 18:30:35
我用nanodrop测了下浓度，一共回收了两管，一个30ng/ul左右，另一个十几ng，然后50ul体系都是加的1ul模板，最终都没有条带，是不是融合片段本身就不好P.还是里面的杂带太多了，还是其他原因?...

那个测得浓度不一定准，最好跑胶看一下，不要偷懒，试着把模板的量加大，一般PCR主要在于模板与引物，还有尽量使用高保真的酶，开始试的时候用小体系(如：10ul),至于镁浓度离子，如果有精力可以去摸索一下，意见仅供参考啊！这个是不太好做，也可以去查考融合PCR相关的文献，多点耐心加细心吧，祝你成功!