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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 溶解曲线不好荧光定量pcr的数据就用不了吗？
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梦梦神

新虫 (初入文坛)

[求助] 溶解曲线不好荧光定量pcr的数据就用不了吗？已有6人参与

溶解曲线不好荧光定量pcr的数据就用不了吗？
溶解曲线不好荧光定量pcr的数据就用不了吗？-1[/img]
以PCR产物纯化后为模板进行荧光定量PCR，目的基因nxrB，如图
1溶解曲线的这两个杂峰第一个是二聚体第二个是非特异性扩增是吗？
2我退火温度从55提高一直到这次的63度，引物浓度也减半了（到5uM)可二聚体还是存在，这种情况该怎么优化实验条件？
3引物序列是根据文献上应该说比较成熟了的来合成的，看到些帖子说是污染了，在不重提DNA前提下有哪些地方可以优化的呢？
4扩增曲线看还是可以的，但是不是溶解曲线不好数据就完全用不了啊？
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1楼2014-08-06 10:30:01
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-08-20 16:56:40
你的图是有引物二聚体以及非特异信不过扩增。
解决方案：
1.减少酶的用量。
2.稀释引物浓度，我使用的是200mM.你的浓度太大引物的，你看看你的SYBR I 要求的最佳浓度时多少。
（以上2个步骤可以按照普通PCR来进行摸索 优化条件以后在上荧光 这样节约试剂）
3.重新设计引物（最根本的方法）
4.稀释模板浓度，我一般吧普通PCR的产物取用稀释10-3次方到10-7次方来做。
4.有可能是有分子污染，建议配试剂和加样在不同房间进行，一次加样一个枪头，操作间要是没条件的话，你可以使用大量酒精喷工作台，搽干净桌面。或者是用大量水冲洗工作台。并且QPCR产物不要乱扔，尽量丢远点，我一般丢在其他实验室操作间以外的的垃圾桶。希望对你有用 手打 不容易 祝顺利
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生命不息奋斗不止
8楼2014-08-08 17:47:21
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
把PCR产物连到T载体上去测个序，如果测序结果不错就qPCR结果就可以用
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
2楼2014-08-06 11:17:10
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
产物不纯可信度差
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3楼2014-08-06 11:30:42
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梦梦神(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-06 13:15:56
梦梦神: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-07 16:39:54
1.是的，解决方法：将现有引物稀释100倍试一下或者重新设计引物
2，引物稀释100倍:
3，可以重新设计引物
4，溶解曲线这个样子说明有非特异性扩增，qPCR本身就是非常灵敏的实验，这个数据是不可信的
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4楼2014-08-06 12:34:23
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贤愚Libra

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-20 16:57:11
溶解曲线非单一峰，这样的数据不能用，可以跑个电泳看下是否有非特异扩增，如果有，那建议换引物，如果只是有引物二聚体，那再降低引物用量试试。
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www------sr-------------
7楼2014-08-06 16:41:44
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普通回帖

happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-06 15:53:19
梦梦神: 金币+7, ★★★很有帮助 2014-08-07 16:40:06
数据不能用，溶解曲线不是单一的峰，说明有非特异性扩增。
不知道你是要检测拷贝数还是表达量方面的
建议多设计几对引物，至少3对，同时上机做，平行条件看哪对引物好用。
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5楼2014-08-06 15:40:55
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gu666hong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-20 16:56:58
肯定不能用 ，先优化条件再做吧，模板，引物浓度，Mg2+浓度都可以试试，实在不行再重新设计引物，
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6楼2014-08-06 16:07:09
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梦梦神

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2014-08-08 17:47:21
你的图是有引物二聚体以及非特异信不过扩增。
解决方案：
1.减少酶的用量。
2.稀释引物浓度，我使用的是200mM.你的浓度太大引物的，你看看你的SYBR I 要求的最佳浓度时多少。
（以上2个步骤可以按照普通PCR来进 ...

谢谢，除了没换引物其他都是过了，效果依然不好。看来要重新选引物了。谢谢
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9楼2014-08-14 15:07:45
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梦梦神

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by songzuowei at 2014-08-06 12:34:23
1.是的，解决方法：将现有引物稀释100倍试一下或者重新设计引物
2，引物稀释100倍:
3，可以重新设计引物
4，溶解曲线这个样子说明有非特异性扩增，qPCR本身就是非常灵敏的实验，这个数据是不可信的

好的 问题解决中 以后多多交流请多指教
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10楼2014-08-14 15:08:37
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