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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 溶解曲线不好荧光定量pcr的数据就用不了吗？
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梦梦神

新虫 (初入文坛)

[求助] 溶解曲线不好荧光定量pcr的数据就用不了吗？ 已有6人参与

溶解曲线不好荧光定量pcr的数据就用不了吗？
溶解曲线不好荧光定量pcr的数据就用不了吗？-1[/img]
以PCR产物纯化后为模板进行荧光定量PCR，目的基因nxrB，如图
1溶解曲线的这两个杂峰第一个是二聚体第二个是非特异性扩增是吗？
2我退火温度从55提高一直到这次的63度，引物浓度也减半了（到5uM)可二聚体还是存在，这种情况该怎么优化实验条件？
3引物序列是根据文献上应该说比较成熟了的来合成的，看到些帖子说是污染了，在不重提DNA前提下有哪些地方可以优化的呢？
4扩增曲线看还是可以的，但是不是溶解曲线不好数据就完全用不了啊？
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1楼 2014-08-06 10:30:01
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梦梦神

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2014-08-08 17:47:21
你的图是有引物二聚体以及非特异信不过扩增。
解决方案：
1.减少酶的用量。
2.稀释引物浓度，我使用的是200mM.你的浓度太大引物的，你看看你的SYBR I 要求的最佳浓度时多少。
（以上2个步骤可以按照普通PCR来进 ...

谢谢，除了没换引物其他都是过了，效果依然不好。看来要重新选引物了。谢谢
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9楼2014-08-14 15:07:45
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
把PCR产物连到T载体上去测个序，如果测序结果不错就qPCR结果就可以用
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
2楼2014-08-06 11:17:10
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
产物不纯可信度差
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3楼2014-08-06 11:30:42
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梦梦神(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-06 13:15:56
梦梦神: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-07 16:39:54
1.是的，解决方法：将现有引物稀释100倍试一下或者重新设计引物
2，引物稀释100倍:
3，可以重新设计引物
4，溶解曲线这个样子说明有非特异性扩增，qPCR本身就是非常灵敏的实验，这个数据是不可信的
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4楼2014-08-06 12:34:23
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