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溶解曲线不好荧光定量pcr的数据就用不了吗？ 已有6人参与
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  [/img]以PCR产物纯化后为模板进行荧光定量PCR，目的基因nxrB，如图 1溶解曲线的这两个杂峰第一个是二聚体第二个是非特异性扩增是吗？ 2我退火温度从55提高一直到这次的63度，引物浓度也减半了（到5uM)可二聚体还是存在，这种情况该怎么优化实验条件？ 3引物序列是根据文献上应该说比较成熟了的来合成的，看到些帖子说是污染了，在不重提DNA前提下有哪些地方可以优化的呢？ 4扩增曲线看还是可以的，但是不是溶解曲线不好数据就完全用不了啊？ |
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 QPCR 问题简答 |
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冷雁孤旅
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西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-08-20 16:56:40
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-08-20 16:56:40
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你的图是有引物二聚体以及非特异信不过扩增。 解决方案： 1.减少酶的用量。 2.稀释引物浓度，我使用的是200mM.你的浓度太大引物的，你看看你的SYBR I 要求的最佳浓度时多少。 （以上2个步骤可以按照普通PCR来进行摸索 优化条件以后在上荧光 这样节约试剂） 3.重新设计引物（最根本的方法） 4.稀释模板浓度，我一般吧普通PCR的产物取用稀释10-3次方到10-7次方来做。 4.有可能是有分子污染，建议配试剂和加样在不同房间进行，一次加样一个枪头，操作间要是没条件的话，你可以使用大量酒精喷工作台，搽干净桌面。或者是用大量水冲洗工作台。并且QPCR产物不要乱扔，尽量丢远点，我一般丢在其他实验室操作间以外的的垃圾桶。希望对你有用 手打 不容易 祝顺利 |
8楼2014-08-08 17:47:21
空谷幽风
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