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梦梦神

新虫 (初入文坛)

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[求助] 溶解曲线不好荧光定量pcr的数据就用不了吗？已有6人参与

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以PCR产物纯化后为模板进行荧光定量PCR，目的基因nxrB，如图
1溶解曲线的这两个杂峰第一个是二聚体第二个是非特异性扩增是吗？
2我退火温度从55提高一直到这次的63度，引物浓度也减半了（到5uM)可二聚体还是存在，这种情况该怎么优化实验条件？
3引物序列是根据文献上应该说比较成熟了的来合成的，看到些帖子说是污染了，在不重提DNA前提下有哪些地方可以优化的呢？
4扩增曲线看还是可以的，但是不是溶解曲线不好数据就完全用不了啊？

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1楼 2014-08-06 10:30:01

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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

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专业: 环境微生物学

★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-08-20 16:56:40

你的图是有引物二聚体以及非特异信不过扩增。
解决方案：
1.减少酶的用量。
2.稀释引物浓度，我使用的是200mM.你的浓度太大引物的，你看看你的SYBR I 要求的最佳浓度时多少。
（以上2个步骤可以按照普通PCR来进行摸索优化条件以后在上荧光这样节约试剂）
3.重新设计引物（最根本的方法）
4.稀释模板浓度，我一般吧普通PCR的产物取用稀释10-3次方到10-7次方来做。
4.有可能是有分子污染，建议配试剂和加样在不同房间进行，一次加样一个枪头，操作间要是没条件的话，你可以使用大量酒精喷工作台，搽干净桌面。或者是用大量水冲洗工作台。并且QPCR产物不要乱扔，尽量丢远点，我一般丢在其他实验室操作间以外的的垃圾桶。希望对你有用手打不容易祝顺利