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北化方华

铁虫 (初入文坛)

[求助] 加了酶切位点和保护碱基的引物Tm值计算及PCR问题。急急急 已有7人参与

加了酶切位点和保护碱基后tm值增加了30度，本身引物就50度了，而且长度很短15bp左右，做过各种梯度和分布PCR，P出来的时候很少很少，加了GCbuffer或者DMSO后也没P出来，跑胶都是非特性性条带，一大条的涂带那种，现在想试下touch down，不知道用哪个Tm值设置，好忧伤。
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1楼 2014-08-04 15:12:13
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-04 17:09:07
北化方华: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-08-05 17:40:46
妹子 我支你一招 你先不加酶切位点和保护碱基去扩增，P出目的条带后，回收做模板再用加酶切位点和保护碱基的引物再扩一遍
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2楼2014-08-04 15:44:06
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北化方华

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by happydove at 2014-08-04 17:27:55
我们经常做酶切位点和保护碱基的，用软件设计引物时直接就加好的，设计完就直接用Tm値扩。是不是你引物设计的问题  特异结合部分引物长度至少要15bp

引物是有点短，我又加长了几bp，tm值又升高了，现在是加酶切位点后的是86，不算酶切位点的是56。
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9楼2014-08-04 17:40:14
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jxph086076

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
北化方华: 金币+2 2014-08-06 16:26:15
用的哪个内切酶序列，这么高的Tm，最好把你的整个引物序列都贴出来，要不然没法分析。
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10楼2014-08-04 18:12:02
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普通回帖

北化方华

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by songzuowei at 2014-08-04 15:44:06
妹子 我支你一招 你先不加酶切位点和保护碱基去扩增，P出目的条带后，回收做模板再用加酶切位点和保护碱基的引物再扩一遍

这样可以吗，那之后用啥温度扩增呢
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3楼2014-08-04 16:09:20
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-04 17:09:22
加入酶切位点和保护碱基之后，计算引物的Tm值时不受影响的，只计算跟模板序列结合的那段引物序列的Tm就可以了
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rainwater
4楼2014-08-04 16:09:59
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北化方华

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-08-04 16:09:59
加入酶切位点和保护碱基之后，计算引物的Tm值时不受影响的，只计算跟模板序列结合的那段引物序列的Tm就可以了

看网上有的这样说，前几个循环酶切位点不参与解链，后来的循环是参与其中的，应该算上。
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5楼2014-08-04 16:19:24
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 北化方华 at 2014-08-04 16:09:20
这样可以吗，那之后用啥温度扩增呢...

这样以后你可以尝试3个温度：50，55，,,60°
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6楼2014-08-04 16:47:54
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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北化方华(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-04 19:40:36
我们经常做酶切位点和保护碱基的，用软件设计引物时直接就加好的，设计完就直接用Tm値扩。是不是你引物设计的问题  特异结合部分引物长度至少要15bp
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7楼2014-08-04 17:27:55
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北化方华

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by songzuowei at 2014-08-04 16:47:54
这样以后你可以尝试3个温度：50，55，,,60°...

那我明天试下吧，希望能成功。谢啦
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8楼2014-08-04 17:38:34
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