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北化方华

铁虫 (初入文坛)

[求助] 加了酶切位点和保护碱基的引物Tm值计算及PCR问题。急急急 已有7人参与

加了酶切位点和保护碱基后tm值增加了30度,本身引物就50度了,而且长度很短15bp左右,做过各种梯度和分布PCR,P出来的时候很少很少,加了GCbuffer或者DMSO后也没P出来,跑胶都是非特性性条带,一大条的涂带那种,现在想试下touch down,不知道用哪个Tm值设置,好忧伤。
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北化方华

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by songzuowei at 2014-08-04 15:44:06
妹子 我支你一招 你先不加酶切位点和保护碱基去扩增,P出目的条带后,回收做模板再用加酶切位点和保护碱基的引物再扩一遍

这样可以吗,那之后用啥温度扩增呢
3楼2014-08-04 16:09:20
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-08-04 17:09:07
北化方华: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-08-05 17:40:46
妹子 我支你一招 你先不加酶切位点和保护碱基去扩增,P出目的条带后,回收做模板再用加酶切位点和保护碱基的引物再扩一遍
2楼2014-08-04 15:44:06
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-08-04 17:09:22
加入酶切位点和保护碱基之后,计算引物的Tm值时不受影响的,只计算跟模板序列结合的那段引物序列的Tm就可以了
rainwater
4楼2014-08-04 16:09:59
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北化方华

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-08-04 16:09:59
加入酶切位点和保护碱基之后,计算引物的Tm值时不受影响的,只计算跟模板序列结合的那段引物序列的Tm就可以了

看网上有的这样说,前几个循环酶切位点不参与解链,后来的循环是参与其中的,应该算上。
5楼2014-08-04 16:19:24
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