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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 加了酶切位点和保护碱基的引物Tm值计算及PCR问题。急急急
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jiaowenqiang

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议重新设计引物，Tm高问题不大，可能是你的引物里GC含量太高
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11楼2014-08-05 08:19:18
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songzuowei
引用回帖:
8楼: Originally posted by 北化方华 at 2014-08-04 17:38:34
那我明天试下吧，希望能成功。谢啦...

12楼2014-08-05 08:38:24
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你把序列给我，用什么酶切位点，我帮你设计一下看看？
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13楼2014-08-05 13:28:22
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zhuxinyu0114

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物长度还是适当搞长一点，一般25bp左右好一点吧，Tm值也不用太在意，一般两条引物GC比例接近，含量在40-60%都可接受，用保护性碱基对GC含量调平
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14楼2014-08-05 14:29:59
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
Tm 50太低，15 bp很容易错配，PCR退火温度不要高于50
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15楼2014-08-05 14:58:29
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北化方华

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by jxph086076 at 2014-08-04 18:12:02
用的哪个内切酶序列，这么高的Tm，最好把你的整个引物序列都贴出来，要不然没法分析。

kpn1和xho1，加上最合适的保护碱基。就达30度了
A-F        CGGGGTACC     ATGAACGACCAAACGCAATT
A-R        CCGCTCGAG     TTAATCTAGGTCATCATCAATT
B-F        CCGCAGTACT    ATGACCACCACTGCCCAA
B-R        CCGCTCGAG      TCAAACCTTTGCGCCGG
很奇怪，今天的引物单上给的竟是没加保护碱基和酶切位点的tm值，上次就给加了。
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16楼2014-08-05 17:46:49
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北化方华

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by happydove at 2014-08-05 13:28:22
你把序列给我，用什么酶切位点，我帮你设计一下看看？

你邮箱多少，我发给你
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17楼2014-08-05 18:16:55
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jxph086076

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 北化方华 at 2014-08-05 17:46:49
kpn1和xho1，加上最合适的保护碱基。就达30度了
A-F        CGGGGTACC     ATGAACGACCAAACGCAATT
A-R        CCGCTCGAG     TTAATCTAGGTCATCATCAATT
B-F        CCGCAGTACT    ATGACCACCACTGCCCAA
B-R        CCGCTCGAG      TCAAACCTTTGCG ...

我最近也用了KpnI，加上NheI。
这是我的primer信息。
Forward：CCgctagcATGTCCTTCGAGGGAGCCA Tm 65.7
Reverse：GCggtaccGCCTTGATGTTATTAGCAAT
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18楼2014-08-05 20:35:13
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jxph086076

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 北化方华 at 2014-08-05 17:46:49
kpn1和xho1，加上最合适的保护碱基。就达30度了
A-F        CGGGGTACC     ATGAACGACCAAACGCAATT
A-R        CCGCTCGAG     TTAATCTAGGTCATCATCAATT
B-F        CCGCAGTACT    ATGACCACCACTGCCCAA
B-R        CCGCTCGAG      TCAAACCTTTGCG ...

Reverse的Tm是59.8
你是做sublconing把，我最近才做了个GFP fusion蛋白，用的Takara的PrimeStar，PCR退火温度是55度。我做subcloning的时候退火温度基本上都是55度。因为用的是纯化的质粒，也不用担心非特异性条带。你可以试试这个方法。
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19楼2014-08-05 20:40:19
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happydove

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 北化方华 at 2014-08-05 18:16:55
你邮箱多少，我发给你...

happydove_2008@126.com
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20楼2014-08-06 15:10:48
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