24小时热门版块排行榜    

查看: 3783  |  回复: 21

jiaowenqiang

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议重新设计引物,Tm高问题不大,可能是你的引物里GC含量太高
11楼2014-08-05 08:19:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 北化方华 at 2014-08-04 17:38:34
那我明天试下吧,希望能成功。谢啦...

12楼2014-08-05 08:38:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你把序列给我,用什么酶切位点,我帮你设计一下看看?
13楼2014-08-05 13:28:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhuxinyu0114

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引物长度还是适当搞长一点,一般25bp左右好一点吧,Tm值也不用太在意,一般两条引物GC比例接近,含量在40-60%都可接受,用保护性碱基对GC含量调平
14楼2014-08-05 14:29:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
Tm 50太低,15 bp很容易错配,PCR退火温度不要高于50
15楼2014-08-05 14:58:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

北化方华

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by jxph086076 at 2014-08-04 18:12:02
用的哪个内切酶序列,这么高的Tm,最好把你的整个引物序列都贴出来,要不然没法分析。

kpn1和xho1,加上最合适的保护碱基。就达30度了
A-F        CGGGGTACC     ATGAACGACCAAACGCAATT
A-R        CCGCTCGAG     TTAATCTAGGTCATCATCAATT
B-F        CCGCAGTACT    ATGACCACCACTGCCCAA
B-R        CCGCTCGAG      TCAAACCTTTGCGCCGG
很奇怪,今天的引物单上给的竟是没加保护碱基和酶切位点的tm值,上次就给加了。
16楼2014-08-05 17:46:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

北化方华

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
13楼: Originally posted by happydove at 2014-08-05 13:28:22
你把序列给我,用什么酶切位点,我帮你设计一下看看?

你邮箱多少,我发给你
17楼2014-08-05 18:16:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jxph086076

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 北化方华 at 2014-08-05 17:46:49
kpn1和xho1,加上最合适的保护碱基。就达30度了
A-F        CGGGGTACC     ATGAACGACCAAACGCAATT
A-R        CCGCTCGAG     TTAATCTAGGTCATCATCAATT
B-F        CCGCAGTACT    ATGACCACCACTGCCCAA
B-R        CCGCTCGAG      TCAAACCTTTGCG ...

我最近也用了KpnI,加上NheI。
这是我的primer信息。
Forward:CCgctagcATGTCCTTCGAGGGAGCCA Tm 65.7
Reverse:GCggtaccGCCTTGATGTTATTAGCAAT
18楼2014-08-05 20:35:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jxph086076

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 北化方华 at 2014-08-05 17:46:49
kpn1和xho1,加上最合适的保护碱基。就达30度了
A-F        CGGGGTACC     ATGAACGACCAAACGCAATT
A-R        CCGCTCGAG     TTAATCTAGGTCATCATCAATT
B-F        CCGCAGTACT    ATGACCACCACTGCCCAA
B-R        CCGCTCGAG      TCAAACCTTTGCG ...

Reverse的Tm是59.8
你是做sublconing把,我最近才做了个GFP fusion蛋白,用的Takara的PrimeStar,PCR退火温度是55度。我做subcloning的时候退火温度基本上都是55度。因为用的是纯化的质粒,也不用担心非特异性条带。你可以试试这个方法。
19楼2014-08-05 20:40:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happydove

新虫 (小有名气)

引用回帖:
17楼: Originally posted by 北化方华 at 2014-08-05 18:16:55
你邮箱多少,我发给你...

happydove_2008@126.com
20楼2014-08-06 15:10:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 北化方华 的主题更新
信息提示
请填处理意见