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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 菌落PCR第一次有，第二次就没有了？什么原因
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swach

铁虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR第一次有，第二次就没有了？什么原因 已有6人参与

昨天做菌落PCR ，第一次没出来，全是拖带，考虑是引物（M13）的问题，所以换了引物，随机选了16个菌液做菌落PCR，结果出来了10个，觉得比例还行，今天就把96个全跑了PCR，之后挑了22个跑电泳，结果基本全是拖带,而且点样孔的地方特别亮，只有三四个有条带的，还很暗。大神，请求帮忙！！！！真的很急，已经做了一个月了。
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1楼 2014-08-03 20:06:12
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-08-04 10:24:54
你做菌液PCR是要做什么？如果是为了提质粒，既然已经出来了十个了，就可以用那十个就好了。

-至于你挑96个跑22个，有可能你跑的这些都不是阳性菌落，不如索性都跑了
-而且一个板子上挑96个，估计单菌落的密度不算小，有可能很多都是假阳性，可以减少菌液涂板量
-至于点样孔亮有可能是因为你的胶有问题
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
2楼2014-08-03 20:25:10
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swach

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by usky_4 at 2014-08-03 20:25:10
你做菌液PCR是要做什么？如果是为了提质粒，既然已经出来了十个了，就可以用那十个就好了。

-至于你挑96个跑22个，有可能你跑的这些都不是阳性菌落，不如索性都跑了
-而且一个板子上挑96个，估计单菌落的密度不 ...

菌液PCR是为了验证目的基因是否转化克隆成功，胶值得不会有问题吧，每次都是1%的胶。
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3楼2014-08-03 20:31:53
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-04 14:10:41
PCR的条件是否合适？模板浓度太高也会抑制PCR。
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4楼2014-08-04 12:13:14
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-04 14:10:06
这明显不科学嘛 你既然是阳性鉴定 有10个鉴定出来了 就说明那10个是阳性 你把96个PCR挑22个跑电泳1个阳性也没有 这绝对是PCR体系的问题 不可能全部都不是 有可能是你的菌液浓度问题？
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5楼2014-08-04 12:28:53
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-04 14:10:52
那就把那10个提质粒不就好了，有阳性克隆就够了。另外点样孔附近很亮，那是挑的菌量有点多，是蛋白质，糖等成分

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天道酬勤
6楼2014-08-04 12:55:02
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

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菌液PCR的假阳性的原因和解决方法(凌波丽，2014年7月24日)

1.建议楼主做阴性对照，阳性对照，检查是否存在污染。
2.假阳性可能的来源是未能和载体连接上的插入片段，这不相当于普通PCR的模板提取的那一步，这步的关键可能是保证挑的细菌克隆的确都能保证是阳性克隆。
3.菌液PCR假阳性也可能是引物设计有问题，引起不专一性PCR扩增。
4.可以加强DNA聚合酶的专一性（这步和普通PCR相同）：
    （1）Taq DNA聚合酶的专一性扩增不够。改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。
    （2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入菌液PCR反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。
    （3）在反应体系中加入：1.0mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以稳定 DNA聚合酶。
5.是否存在菌液PCR的反应体系之外的DNA污染源
    菌液PCR的反应体系被污染：这种污染有两种原因：
    第一种可能：大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。
    这种非特异性带出现可用以下方法解决：
   （1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止以前操作时将其他的DNA靶序列吸入加样枪内。
   （2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
   （3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
    第二种可能：空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。
    对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间。
6.反应体系过大，模板DNA和非模板DNA过多引起了非特异性扩增。
7. 目的DNA模板可能本身存在某些问题，比如与一些蛋白质发生了较牢固的结合（特异性或者非特异性）-----因为细菌也有类核，而这样的结合在裂解细菌由于某些因素没有去除，或者目的DNA模板的拓扑结构有某些问题。第7点只是我从细菌分子生物学角度做的猜测。第7条成为原因的可能性极小。
因为如果挑的阳性克隆没有问题，同时PCR的引物也肯定能够与目的模板互补的话，那么出现目的DNA扩增片段应该不是问题，也可能有非特异性扩增存在，但是只有非特异性扩增的话，所以此时就要考虑什么原因阻止了目的DNA的扩增。
8.引物的特异性差，受非特异性的PCR扩增的竞争性抑制作用的影响，靶基因的PCR扩增效率低，特异性的PCR产物极少。第1条措施到第6条措施均无效，则必须考虑重新设计引物。

可能有网友会说我想的太多了，想得多不多没有太大意义，关键是能不能解决问题，方案是否有可操作性。
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7楼2014-08-05 01:51:44
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌夜pcr要养成良好的习惯！每次PCR必须要有阳性对照（模板可以为质粒或菌液，反正能确定p出目的带的就行）和阴性对照（模板为水）！这样就可以确定你的反应体系和条件有没问题！此外，你两次PCR隔的时间是不有点久？菌夜在冰箱放太久是比较难扩的。另外加模板前，把菌多摇晃一下混匀，不然吸上清（模板太少可能没有）或吸到管底沉菌（模板太多）都会不利于扩增！

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8楼2014-08-05 03:12:39
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