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swach

铁虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR第一次有,第二次就没有了?什么原因 已有6人参与

昨天做菌落PCR ,第一次没出来,全是拖带,考虑是引物(M13)的问题,所以换了引物,随机选了16个菌液做菌落PCR,结果出来了10个,觉得比例还行,今天就把96个全跑了PCR,之后挑了22个跑电泳,结果基本全是拖带,而且点样孔的地方特别亮,只有三四个有条带的,还很暗。大神,请求帮忙!!!!真的很急,已经做了一个月了。
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
菌夜pcr要养成良好的习惯!每次PCR必须要有阳性对照(模板可以为质粒或菌液,反正能确定p出目的带的就行)和阴性对照(模板为水)!这样就可以确定你的反应体系和条件有没问题!此外,你两次PCR隔的时间是不有点久?菌夜在冰箱放太久是比较难扩的。另外加模板前,把菌多摇晃一下混匀,不然吸上清(模板太少可能没有)或吸到管底沉菌(模板太多)都会不利于扩增!

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-08-05 03:12:39
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查看全部 8 个回答

usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-08-04 10:24:54
你做菌液PCR是要做什么?如果是为了提质粒,既然已经出来了十个了,就可以用那十个就好了。

-至于你挑96个跑22个,有可能你跑的这些都不是阳性菌落,不如索性都跑了
-而且一个板子上挑96个,估计单菌落的密度不算小,有可能很多都是假阳性,可以减少菌液涂板量
-至于点样孔亮有可能是因为你的胶有问题
下次再见面的时候,我们一定会笑着相遇吧
2楼2014-08-03 20:25:10
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swach

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by usky_4 at 2014-08-03 20:25:10
你做菌液PCR是要做什么?如果是为了提质粒,既然已经出来了十个了,就可以用那十个就好了。

-至于你挑96个跑22个,有可能你跑的这些都不是阳性菌落,不如索性都跑了
-而且一个板子上挑96个,估计单菌落的密度不 ...

菌液PCR是为了验证目的基因是否转化克隆成功,胶值得不会有问题吧,每次都是1%的胶。
3楼2014-08-03 20:31:53
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-08-04 14:10:41
PCR的条件是否合适?模板浓度太高也会抑制PCR。
4楼2014-08-04 12:13:14
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