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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 菌落PCR第一次有，第二次就没有了？什么原因
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swach

铁虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR第一次有，第二次就没有了？什么原因 已有6人参与

昨天做菌落PCR ，第一次没出来，全是拖带，考虑是引物（M13）的问题，所以换了引物，随机选了16个菌液做菌落PCR，结果出来了10个，觉得比例还行，今天就把96个全跑了PCR，之后挑了22个跑电泳，结果基本全是拖带,而且点样孔的地方特别亮，只有三四个有条带的，还很暗。大神，请求帮忙！！！！真的很急，已经做了一个月了。
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1楼 2014-08-03 20:06:12
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌夜pcr要养成良好的习惯！每次PCR必须要有阳性对照（模板可以为质粒或菌液，反正能确定p出目的带的就行）和阴性对照（模板为水）！这样就可以确定你的反应体系和条件有没问题！此外，你两次PCR隔的时间是不有点久？菌夜在冰箱放太久是比较难扩的。另外加模板前，把菌多摇晃一下混匀，不然吸上清（模板太少可能没有）或吸到管底沉菌（模板太多）都会不利于扩增！

[ 发自小木虫客户端 ]
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8楼2014-08-05 03:12:39
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-08-04 10:24:54
你做菌液PCR是要做什么？如果是为了提质粒，既然已经出来了十个了，就可以用那十个就好了。

-至于你挑96个跑22个，有可能你跑的这些都不是阳性菌落，不如索性都跑了
-而且一个板子上挑96个，估计单菌落的密度不算小，有可能很多都是假阳性，可以减少菌液涂板量
-至于点样孔亮有可能是因为你的胶有问题
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
2楼2014-08-03 20:25:10
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swach

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by usky_4 at 2014-08-03 20:25:10
你做菌液PCR是要做什么？如果是为了提质粒，既然已经出来了十个了，就可以用那十个就好了。

-至于你挑96个跑22个，有可能你跑的这些都不是阳性菌落，不如索性都跑了
-而且一个板子上挑96个，估计单菌落的密度不 ...

菌液PCR是为了验证目的基因是否转化克隆成功，胶值得不会有问题吧，每次都是1%的胶。
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3楼2014-08-03 20:31:53
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-04 14:10:41
PCR的条件是否合适？模板浓度太高也会抑制PCR。
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4楼2014-08-04 12:13:14
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