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汕头大学海洋科学接受调剂
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mmojf

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达不表达 已有6人参与

求助,刚开始做表达,目的是为了研究蛋白功能,但是在表达上就遇到了困难,RNA序列是1224bp,进行了在线稀有密码子分析和可溶性分析,结果如附件图:含有20几个稀有密码子,在大肠杆菌中“The input sequence has a 0.0 percent  chance of solubility  when overexpressed in  E. Coli.”;载体为PET28a,选择酶切位点分别为Ecor1和Hind3,表达感受态使用过BL21(DE3)和ROSETTA。蛋白不表达,应该怎样解决呢,求高手解答

原核表达不表达
可溶性.jpg


原核表达不表达-1
密码子.jpg
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dy_414

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
mmojf(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-31 08:57:19
第一,20个rare codon不是个小数目,lz可以使用rosetta表达,现在国内价格都不贵,效果很好。
第二,PET28本身表达效率就不是很高,建议尝试其他载体。

祝好运
我坚信,rp是攒出来的
7楼2014-07-31 01:26:28
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小苹果168

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by mmojf at 2014-08-04 15:10:10
该段基因是来自于真核生物,是否这种情况说明这个蛋白无法进行原核表达?...

应该是吧,而且原核系统很难正确修饰糖基化,甲基化,真核表达的蛋白结构更接近天然蛋白结构

[ 发自小木虫客户端 ]
19楼2014-08-05 08:34:58
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普通回帖

小小cool

金虫 (正式写手)

用别的载体试试

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2014-07-30 10:34:22
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
顶楼上!果断换表达载体和表达菌株
3楼2014-07-30 13:26:16
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
mmojf(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-31 08:56:18
不表达,实验方法没问题的话,有两个办法供选择:换其他载体和换其他表达系统。
祝你成功!
4楼2014-07-30 15:48:04
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)

感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2014-07-31 08:53:47
你好,冒昧的问一下,你昨晚转化之后有没有进行鉴定来确定是否转化成功?
坚持到底就是胜利!
5楼2014-07-30 15:49:37
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
mmojf(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-31 08:56:54
遇到过类似的问题,用codonPlus里的RIPL菌株,得到了解决,不知对你的蛋白有无作用
行至水穷处,坐看云起时
6楼2014-07-30 22:17:36
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小苹果168

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
很多时候原核系统表达不了的蛋白,可以用真核系统表达

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-07-31 08:28:24
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

引用回帖:
7楼: Originally posted by dy_414 at 2014-07-31 01:26:28
第一,20个rare codon不是个小数目,lz可以使用rosetta表达,现在国内价格都不贵,效果很好。
第二,PET28本身表达效率就不是很高,建议尝试其他载体。

祝好运

请问你有相关的文献证明pET28a表达效率低吗?
植根于内心的修养;无需提醒的自觉;以约束为前提的自由;为别人着想的善良
9楼2014-07-31 09:11:04
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0405lanfeng

新虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by pennchem at 2014-07-30 22:17:36
遇到过类似的问题,用codonPlus里的RIPL菌株,得到了解决,不知对你的蛋白有无作用

请问这个是可以解决稀有密码子问题吗?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
10楼2014-07-31 17:40:37
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