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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 原核表达不表达
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mmojf

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达不表达 已有6人参与

求助，刚开始做表达，目的是为了研究蛋白功能，但是在表达上就遇到了困难，RNA序列是1224bp，进行了在线稀有密码子分析和可溶性分析，结果如附件图：含有20几个稀有密码子，在大肠杆菌中“The input sequence has a 0.0 percent  chance of solubility  when overexpressed in  E. Coli.”；载体为PET28a，选择酶切位点分别为Ecor1和Hind3，表达感受态使用过BL21（DE3）和ROSETTA。蛋白不表达，应该怎样解决呢，求高手解答

原核表达不表达
可溶性.jpg


原核表达不表达-1
密码子.jpg
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1楼 2014-07-30 09:41:42
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

dy_414

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
mmojf(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-31 08:57:19
第一，20个rare codon不是个小数目，lz可以使用rosetta表达，现在国内价格都不贵，效果很好。
第二，PET28本身表达效率就不是很高，建议尝试其他载体。

祝好运
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我坚信，rp是攒出来的
7楼2014-07-31 01:26:28
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小苹果168

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by mmojf at 2014-08-04 15:10:10
该段基因是来自于真核生物，是否这种情况说明这个蛋白无法进行原核表达？...

应该是吧，而且原核系统很难正确修饰糖基化，甲基化，真核表达的蛋白结构更接近天然蛋白结构

[ 发自小木虫客户端 ]
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19楼2014-08-05 08:34:58
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普通回帖

小小cool

金虫 (正式写手)
用别的载体试试

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-07-30 10:34:22
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
顶楼上！果断换表达载体和表达菌株
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3楼2014-07-30 13:26:16
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
mmojf(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-31 08:56:18
不表达，实验方法没问题的话，有两个办法供选择：换其他载体和换其他表达系统。
祝你成功！
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4楼2014-07-30 15:48:04
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2014-07-31 08:53:47
你好，冒昧的问一下，你昨晚转化之后有没有进行鉴定来确定是否转化成功？
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坚持到底就是胜利！
5楼2014-07-30 15:49:37
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
mmojf(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-31 08:56:54
遇到过类似的问题，用codonPlus里的RIPL菌株，得到了解决，不知对你的蛋白有无作用
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行至水穷处，坐看云起时
6楼2014-07-30 22:17:36
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小苹果168

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很多时候原核系统表达不了的蛋白，可以用真核系统表达

[ 发自小木虫客户端 ]
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8楼2014-07-31 08:28:24
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by dy_414 at 2014-07-31 01:26:28
第一，20个rare codon不是个小数目，lz可以使用rosetta表达，现在国内价格都不贵，效果很好。
第二，PET28本身表达效率就不是很高，建议尝试其他载体。

祝好运

请问你有相关的文献证明pET28a表达效率低吗？
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
9楼2014-07-31 09:11:04
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0405lanfeng

新虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by pennchem at 2014-07-30 22:17:36
遇到过类似的问题，用codonPlus里的RIPL菌株，得到了解决，不知对你的蛋白有无作用

请问这个是可以解决稀有密码子问题吗？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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10楼2014-07-31 17:40:37
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