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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因组PCR用于验证RT-PCR引物的实验思路，请大虾们把把关
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cathy97031

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因组PCR用于验证RT-PCR引物的实验思路，请大虾们把把关 已有7人参与

本人要做昆虫组织中某种基因的表达谱研究，现初拟实验方案如下，因实验第一步就出问题了，所以请各位大虾把把关，是我的方案本身就有问题还是实验操作的问题，也请有经验者给点建议：
    1、网上数据库中查到该物种相关基因的所有序列信息，但是不确定这些基因是否都表达，所有要通过RT-PCR来验证。
    2、做RT-PCR之前为了确保引物的可用性，本人根据这些序列信息在外显子区域选择合适片段作为引物，而扩增出来的片段夸内含子区域，大小在1000bp左右。
    3、用天根的快速DNA提取试剂盒提取该昆虫的基因组DNA，用设计好的引物进行PCR扩增。
    4、能够扩增出对应大小的片段即说明该对引物可用于后续的RT-PCR实验。
    5、RT-PCR
    ......
    但是现在遇到的问题是，我提取的基因组DNA怎么都扩增不出条带来，除了引物二聚体其他什么都没有，引物试了好几对都是一样的结果；就在这时，我发现基因组提取试剂盒过期了至少两个月。于是我就不知道是因为试剂盒过期导致的基因组提取失败还是我的引物有问题，我目前没有扩增过该昆虫的任何基因，所以没办法做对照实验，那我该怎么办啊？试剂盒的保质期就那么严格的吗？还是我的实验本身就有问题呢？请大家评评......
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1楼 2014-07-29 13:06:38
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cathy97031(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-30 14:31:29
用内参基因的引物扩增一下看看你的基因组好了。
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大家相互帮助哈
4楼2014-07-29 14:28:47
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-29 15:31:18
你这里有一个很严重的问题，做基因的表达谱研究，为什么你去提基因组而不是抽提某组织的RNA逆转录成cDNA，以此为模板做呢？另：实时定量PCR叫做qPCR而不是RT-PCR
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5楼2014-07-29 14:29:53
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yaolinlshang

金虫 (正式写手)
★
cathy97031(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-30 14:31:47
引用回帖:
5楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-29 14:29:53
你这里有一个很严重的问题，做基因的表达谱研究，为什么你去提基因组而不是抽提某组织的RNA逆转录成cDNA，以此为模板做呢？另：实时定量PCR叫做qPCR而不是RT-PCR

对啊。可以先提取基因组DNA，以你设计的因为为模板，扩增你需要的基因。如果成功的话，再提取RNA，转成cDNA，在进行后续的定点定量分析表达。还有一点哦，你可以先试试半定量，确定没问题后，再选择定量。
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最是人间留不住，朱颜辞镜花辞树！
10楼2014-07-29 15:33:51
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柠萌粉

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
盒子过期还好吧，你把提的基因组的跑胶图发上来看看
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2楼2014-07-29 13:18:54
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愚者517

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
first,  you do not confirm your genomic DNA templet sequence or not  distinctive.
second，  Maybe you do not extract  insect genomic DNA.
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3楼2014-07-29 14:14:58
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cathy97031

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 柠萌粉 at 2014-07-29 13:18:54
盒子过期还好吧，你把提的基因组的跑胶图发上来看看

之前跑过电泳了，什么都没有，只有几百bp的地方有弥散条带。
今天打电话给天根的技术支持，对方说这个试剂盒提出来的基因组不建议跑胶，对方认为有可能是试剂盒过期了。可是我也觉得过期不至于啊
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6楼2014-07-29 15:15:53
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cathy97031

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 愚者517 at 2014-07-29 14:14:58
first,  you do not confirm your genomic DNA templet sequence or not  distinctive.
second，  Maybe you do not extract  insect genomic DNA.

现在我就是不知道是模板的问题还是引物都有问题
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7楼2014-07-29 15:16:56
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cathy97031

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-29 14:28:47
用内参基因的引物扩增一下看看你的基因组好了。

请问内参引物是什么呢？怎么能够查到？我以前没有接触过这个。谢谢
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8楼2014-07-29 15:18:03
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cathy97031

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-29 14:29:53
你这里有一个很严重的问题，做基因的表达谱研究，为什么你去提基因组而不是抽提某组织的RNA逆转录成cDNA，以此为模板做呢？另：实时定量PCR叫做qPCR而不是RT-PCR

可能我上面没有表达清楚：我最后是要用cDNA为模板一个个试，看哪个基因表达了，来确定表达谱。但是在这之前我想先验证我的引物是ok的，所以我就先用基因组来作为模板，考虑到真核生物的内含子，所以我在选择引物的时候保证扩增出来的序列夸内含子区，并且长度在1kb左右。
另外，我最后要做的就是逆转录PCR（RT-PCR），我还不考虑做qPCR。
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9楼2014-07-29 15:22:30
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