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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因组PCR用于验证RT-PCR引物的实验思路，请大虾们把把关
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by cathy97031 at 2014-07-29 15:22:30
可能我上面没有表达清楚：我最后是要用cDNA为模板一个个试，看哪个基因表达了，来确定表达谱。但是在这之前我想先验证我的引物是ok的，所以我就先用基因组来作为模板，考虑到真核生物的内含子，所以我在选择引物的 ...

电泳检测没条带那是基因组的问题，内参就是你基因组里肯定有的基因比如一些代谢上关键的酶的基因，专门做对照用的。

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大家相互帮助哈
11楼2014-07-29 15:35:11
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cathy97031

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by yaolinlshang at 2014-07-29 15:33:51
对啊。可以先提取基因组DNA，以你设计的因为为模板，扩增你需要的基因。如果成功的话，再提取RNA，转成cDNA，在进行后续的定点定量分析表达。还有一点哦，你可以先试试半定量，确定没问题后，再选择定量。...

bingo，就是这个意思，但是我后面可能不会做到定量PCR，我只想要知道哪些基因是表达的。理论上我的这个思路是可行的吧？可是第一步就受阻了
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12楼2014-07-29 15:41:55
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cathy97031

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-29 15:35:11
电泳检测没条带那是基因组的问题，内参就是你基因组里肯定有的基因比如一些代谢上关键的酶的基因，专门做对照用的。
...

谢谢，我看别的文献用的β-actin，但是不是我的这种昆虫，我的这个就没人做过。我先试试吧。
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13楼2014-07-29 15:45:27
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cathy97031

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by cathy97031 at 2014-07-29 15:45:27
谢谢，我看别的文献用的β-actin，但是不是我的这种昆虫，我的这个就没人做过。我先试试吧。...

GOD,我输入actin找出来好多，应该是哪一个呢？能帮忙看一下吗？
https://www.vectorbase.org/searc ... pheles%20gambiae%22
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14楼2014-07-29 15:57:39
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-29 17:58:20
cathy97031(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-30 14:32:25
引用回帖:
9楼: Originally posted by cathy97031 at 2014-07-29 15:22:30
可能我上面没有表达清楚：我最后是要用cDNA为模板一个个试，看哪个基因表达了，来确定表达谱。但是在这之前我想先验证我的引物是ok的，所以我就先用基因组来作为模板，考虑到真核生物的内含子，所以我在选择引物的 ...

好的，用基因组为模板扩增目的基因，有时候就是不好扩增，这里很关键的一个因素是抽提的基因组质量，好的基因组应该是一条明亮的主带，基因组抽提质量好后扩增时一般将基因组梯度稀释一下做模板，仅供参考
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15楼2014-07-29 16:26:08
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yaolinlshang

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cathy97031 at 2014-07-29 15:41:55
bingo，就是这个意思，但是我后面可能不会做到定量PCR，我只想要知道哪些基因是表达的。理论上我的这个思路是可行的吧？可是第一步就受阻了...

你可以用手提基因组啊，然后用内参基因先试一下，然后再用你的引物扩增。太具体的我不是很明白，我是用现成的引物，没有什么太大的问题。
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最是人间留不住，朱颜辞镜花辞树！
16楼2014-07-30 11:05:59
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未婚

金虫 (正式写手)

分子小生

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-29 14:29:53
你这里有一个很严重的问题，做基因的表达谱研究，为什么你去提基因组而不是抽提某组织的RNA逆转录成cDNA，以此为模板做呢？另：实时定量PCR叫做qPCR而不是RT-PCR

不是吧  有这么一说是叫RT-PCR,也可以叫QRT-PCR，然后逆转录PCR有可以叫RT-PCR。
一般我们做表达谱都是用cDNA，但也有用DNA组的呢！对于为啥呢么用dna，我还不是太清楚，向您请教一下。谢谢！
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You can't depend on luck, so you had better focus on the others!
17楼2014-07-30 12:11:07
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未婚

金虫 (正式写手)

分子小生

【答案】应助回帖

★
cathy97031(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-30 14:32:50
引用回帖:
6楼: Originally posted by cathy97031 at 2014-07-29 15:15:53
之前跑过电泳了，什么都没有，只有几百bp的地方有弥散条带。
今天打电话给天根的技术支持，对方说这个试剂盒提出来的基因组不建议跑胶，对方认为有可能是试剂盒过期了。可是我也觉得过期不至于啊...

试剂盒提出来的DNA不跑胶那怎么判断提出否，我觉得还是应该跑胶！
换一个试剂盒试一试吧，不过  我很好奇，为什么你要用DNA组来跑定量呢？
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18楼2014-07-30 12:13:12
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by 未婚 at 2014-07-30 12:11:07
不是吧  有这么一说是叫RT-PCR,也可以叫QRT-PCR，然后逆转录PCR有可以叫RT-PCR。
一般我们做表达谱都是用cDNA，但也有用DNA组的呢！对于为啥呢么用dna，我还不是太清楚，向您请教一下。谢谢！...

请教不敢当，一般是这样实时定量PCR叫做qPCR,逆转录PCR叫RT-PCR.一般做表达谱都是用cDNA的，因为是真核剪切过后mRNA的表达水平，基本不用基因组DNA做表达谱分析，除非是原核生物可以将就一下
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19楼2014-07-30 13:08:02
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
昆虫的基因组好提吗？不知道你用的什么昆虫材料。有专门提昆虫的试剂盒，但提出来的量可能不是太高。
试剂盒一般没那么严格的时间限制。
同学，你设计实验的思路少了一步，那就是参照。可以验证你整个实验过程有没有问题的对照。可以是看家基因。具体选什么可以多查查文献。
看某一基因的表达情况，要么用半定量PCR，要么用定量PCR。这都要用到内参（上面提到的参照）。
但不太清楚楼主打算用什么方法。
不管怎么说，建议楼主多看看文献，把实验设计好。俗话说，“磨刀不误砍柴工”。
祝楼主好运！
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20楼2014-07-30 16:04:33
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