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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因组PCR用于验证RT-PCR引物的实验思路，请大虾们把把关
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cathy97031

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因组PCR用于验证RT-PCR引物的实验思路，请大虾们把把关 已有7人参与

本人要做昆虫组织中某种基因的表达谱研究，现初拟实验方案如下，因实验第一步就出问题了，所以请各位大虾把把关，是我的方案本身就有问题还是实验操作的问题，也请有经验者给点建议：
    1、网上数据库中查到该物种相关基因的所有序列信息，但是不确定这些基因是否都表达，所有要通过RT-PCR来验证。
    2、做RT-PCR之前为了确保引物的可用性，本人根据这些序列信息在外显子区域选择合适片段作为引物，而扩增出来的片段夸内含子区域，大小在1000bp左右。
    3、用天根的快速DNA提取试剂盒提取该昆虫的基因组DNA，用设计好的引物进行PCR扩增。
    4、能够扩增出对应大小的片段即说明该对引物可用于后续的RT-PCR实验。
    5、RT-PCR
    ......
    但是现在遇到的问题是，我提取的基因组DNA怎么都扩增不出条带来，除了引物二聚体其他什么都没有，引物试了好几对都是一样的结果；就在这时，我发现基因组提取试剂盒过期了至少两个月。于是我就不知道是因为试剂盒过期导致的基因组提取失败还是我的引物有问题，我目前没有扩增过该昆虫的任何基因，所以没办法做对照实验，那我该怎么办啊？试剂盒的保质期就那么严格的吗？还是我的实验本身就有问题呢？请大家评评......
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1楼 2014-07-29 13:06:38
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未婚

金虫 (正式写手)

分子小生

【答案】应助回帖

★
cathy97031(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-30 14:32:50
引用回帖:
6楼: Originally posted by cathy97031 at 2014-07-29 15:15:53
之前跑过电泳了，什么都没有，只有几百bp的地方有弥散条带。
今天打电话给天根的技术支持，对方说这个试剂盒提出来的基因组不建议跑胶，对方认为有可能是试剂盒过期了。可是我也觉得过期不至于啊...

试剂盒提出来的DNA不跑胶那怎么判断提出否，我觉得还是应该跑胶！
换一个试剂盒试一试吧，不过  我很好奇，为什么你要用DNA组来跑定量呢？
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You can't depend on luck, so you had better focus on the others!
18楼2014-07-30 12:13:12
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查看全部 22 个回答

柠萌粉

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
盒子过期还好吧，你把提的基因组的跑胶图发上来看看
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2楼2014-07-29 13:18:54
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愚者517

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
first,  you do not confirm your genomic DNA templet sequence or not  distinctive.
second，  Maybe you do not extract  insect genomic DNA.
赞一下 回复此楼
3楼2014-07-29 14:14:58
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cathy97031(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-30 14:31:29
用内参基因的引物扩增一下看看你的基因组好了。
赞一下(1人) 回复此楼
大家相互帮助哈
4楼2014-07-29 14:28:47
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