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viki_MDK

银虫 (正式写手)

[求助] PCR引物TM值的确定

我的一个引物的Tm为53.7,另一个为72.2,那我的退火温度应该是多少?
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皇马铁卫

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我们一般都用较低引物的Tm至-5℃作为退货温度。
你这个可以试下50度吧,不过这两条引物TM差别怎么这么大,设计有问题吧?
春晓赏花,夏日听蝉,箫吹秋月,酒饮冬霜~
2楼2012-04-27 14:54:15
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流问题。 2012-04-27 18:40:33
你的两条引物Tm值相差有点大,PCR扩增很难,除非你降低温度非特异性少的情况下还可以考虑。
引物的Tm值:Tm=4(G+C)+2(A+T)
Tm值比退火温度高5-15℃
两条引物的Tm值最好相同,相差不要超过3℃

你可以先降低温度试试,如果非特异性带太多的话,建议你重新设计一对引物,让两个引物的Tm值尽量差的不要太多。(个人意见,呵呵)
未来不是梦
3楼2012-04-27 14:54:49
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-28 08:21:21
设计的时候没有注意这个么?感觉这对引物质量不是很好,如果从基因组上p的话不一定好p,退火温度还是应该比最低的那个低5度左右吧
4楼2012-04-27 15:26:37
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 皇马铁卫 at 2012-04-27 14:54:15:
我们一般都用较低引物的Tm至-5℃作为退货温度。
你这个可以试下50度吧,不过这两条引物TM差别怎么这么大,设计有问题吧?

因为我在下游引物上加了组氨酸标签,所以它的退火温度较高。
5楼2012-04-27 15:31:47
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-04-27 14:54:49:
你的两条引物Tm值相差有点大,PCR扩增很难,除非你降低温度非特异性少的情况下还可以考虑。
引物的Tm值:Tm=4(G+C)+2(A+T)
Tm值比退火温度高5-15℃
两条引物的Tm值最好相同,相差不要超过3℃

你可以先降低 ...

我的非特异扩增主要是引物二聚体。
6楼2012-04-27 15:32:57
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-04-27 15:26:37:
设计的时候没有注意这个么?感觉这对引物质量不是很好,如果从基因组上p的话不一定好p,退火温度还是应该比最低的那个低5度左右吧

下游引物上引入了组氨酸标签,所以碱基对数将近50了。
7楼2012-04-27 15:35:15
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
viki_MDK: 金币+5 2012-05-25 18:42:47
看退火温度的话,只看跟你的模板配对时候的退货温度就行,那段组氨酸标签不用算的
8楼2012-04-27 15:41:22
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可帅儿

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
两个TM值加起来除以2,然后再减去5左右,这个温度可以试试
不过我还没试过
追随自己的心!不要做让自己后悔的事!
9楼2012-04-27 15:57:48
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wlf200501

新虫 (正式写手)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这两个引物温度相差比较大啊,是软件设计出来的吗?
10楼2012-04-27 16:41:28
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