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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR引物TM值的确定
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

[求助] PCR引物TM值的确定

我的一个引物的Tm为53.7，另一个为72.2，那我的退火温度应该是多少？
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1楼 2012-04-27 14:42:41
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皇马铁卫

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们一般都用较低引物的Tm至-5℃作为退货温度。
你这个可以试下50度吧，不过这两条引物TM差别怎么这么大，设计有问题吧？
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春晓赏花，夏日听蝉，箫吹秋月，酒饮冬霜~
2楼2012-04-27 14:54:15
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流问题。 2012-04-27 18:40:33
你的两条引物Tm值相差有点大，PCR扩增很难，除非你降低温度非特异性少的情况下还可以考虑。
引物的Tm值：Tm=4（G+C）+2(A+T)
Tm值比退火温度高5-15℃
两条引物的Tm值最好相同，相差不要超过3℃

你可以先降低温度试试，如果非特异性带太多的话，建议你重新设计一对引物，让两个引物的Tm值尽量差的不要太多。（个人意见，呵呵）
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未来不是梦
3楼2012-04-27 14:54:49
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-28 08:21:21
设计的时候没有注意这个么？感觉这对引物质量不是很好，如果从基因组上p的话不一定好p，退火温度还是应该比最低的那个低5度左右吧
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4楼2012-04-27 15:26:37
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 皇马铁卫 at 2012-04-27 14:54:15:
我们一般都用较低引物的Tm至-5℃作为退货温度。
你这个可以试下50度吧，不过这两条引物TM差别怎么这么大，设计有问题吧？

因为我在下游引物上加了组氨酸标签，所以它的退火温度较高。
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5楼2012-04-27 15:31:47
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-04-27 14:54:49:
你的两条引物Tm值相差有点大，PCR扩增很难，除非你降低温度非特异性少的情况下还可以考虑。
引物的Tm值：Tm=4（G+C）+2(A+T)
Tm值比退火温度高5-15℃
两条引物的Tm值最好相同，相差不要超过3℃

你可以先降低 ...

我的非特异扩增主要是引物二聚体。
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6楼2012-04-27 15:32:57
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-04-27 15:26:37:
设计的时候没有注意这个么？感觉这对引物质量不是很好，如果从基因组上p的话不一定好p，退火温度还是应该比最低的那个低5度左右吧

下游引物上引入了组氨酸标签，所以碱基对数将近50了。
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7楼2012-04-27 15:35:15
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
viki_MDK: 金币+5 2012-05-25 18:42:47
看退火温度的话，只看跟你的模板配对时候的退货温度就行，那段组氨酸标签不用算的
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8楼2012-04-27 15:41:22
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可帅儿

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
两个TM值加起来除以2，然后再减去5左右，这个温度可以试试
不过我还没试过
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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！
9楼2012-04-27 15:57:48
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wlf200501

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这两个引物温度相差比较大啊，是软件设计出来的吗？
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10楼2012-04-27 16:41:28
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