应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因组PCR用于验证RT-PCR引物的实验思路，请大虾们把把关
51/1返回列表
查看: 2643  |  回复: 21
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

cathy97031

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因组PCR用于验证RT-PCR引物的实验思路，请大虾们把把关 已有7人参与

本人要做昆虫组织中某种基因的表达谱研究，现初拟实验方案如下，因实验第一步就出问题了，所以请各位大虾把把关，是我的方案本身就有问题还是实验操作的问题，也请有经验者给点建议：
    1、网上数据库中查到该物种相关基因的所有序列信息，但是不确定这些基因是否都表达，所有要通过RT-PCR来验证。
    2、做RT-PCR之前为了确保引物的可用性，本人根据这些序列信息在外显子区域选择合适片段作为引物，而扩增出来的片段夸内含子区域，大小在1000bp左右。
    3、用天根的快速DNA提取试剂盒提取该昆虫的基因组DNA，用设计好的引物进行PCR扩增。
    4、能够扩增出对应大小的片段即说明该对引物可用于后续的RT-PCR实验。
    5、RT-PCR
    ......
    但是现在遇到的问题是，我提取的基因组DNA怎么都扩增不出条带来，除了引物二聚体其他什么都没有，引物试了好几对都是一样的结果；就在这时，我发现基因组提取试剂盒过期了至少两个月。于是我就不知道是因为试剂盒过期导致的基因组提取失败还是我的引物有问题，我目前没有扩增过该昆虫的任何基因，所以没办法做对照实验，那我该怎么办啊？试剂盒的保质期就那么严格的吗？还是我的实验本身就有问题呢？请大家评评......
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-07-29 13:06:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

愚者517

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
first,  you do not confirm your genomic DNA templet sequence or not  distinctive.
second，  Maybe you do not extract  insect genomic DNA.
赞一下 回复此楼
3楼2014-07-29 14:14:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 22 个回答

柠萌粉

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
盒子过期还好吧，你把提的基因组的跑胶图发上来看看
赞一下 回复此楼
2楼2014-07-29 13:18:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cathy97031(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-30 14:31:29
用内参基因的引物扩增一下看看你的基因组好了。
赞一下(1人) 回复此楼
大家相互帮助哈
4楼2014-07-29 14:28:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-29 15:31:18
你这里有一个很严重的问题，做基因的表达谱研究，为什么你去提基因组而不是抽提某组织的RNA逆转录成cDNA，以此为模板做呢？另：实时定量PCR叫做qPCR而不是RT-PCR
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2014-07-29 14:29:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 22 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭