应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于荧光定量PCR扩增曲线的疑问
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
101/1返回列表
查看: 2174  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zhpu2008

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于荧光定量PCR扩增曲线的疑问 已有3人参与

各位大侠好，近两天做荧光定量PCR，但扩增曲线，有的正常，有的不正常，甚至是三个重复里面就差别较大，深蓝色是3个重复，浅蓝色是3个重复，有图附上，大家看看，帮忙分析原因，谢谢！

关于荧光定量PCR扩增曲线的疑问
quxian.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-06-28 09:10:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

茂林修竹7

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
zhpu2008(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励回帖交流 2014-06-28 13:05:06
Real Time PCR根据其原理，可以在PCR体系里加入荧光染料或者用特异性的荧光探针。我经常用的是前者，你的应该也是。
荧光染料法，对引物的要求还是挺高的，根据你的扩增曲线，排除加样过程中的误差，我认为 你的引物不好。
建议你做Relatime之前，最好先把引物检测一下。Relatime检测，就是一个引物准备两个上样孔，A.正常加样；B.把cDNA换成定量的H2O，看溶解曲线。好的引物溶解曲线，A孔只有一个峰，B孔没有峰。
另外加样的时候，最好混合一个体系，计算好用量，一个孔一个孔的分装，微量的如引物最好不要单独加，这样误差很大的。
图片是我做的，你可以参考下。
关于荧光定量PCR扩增曲线的疑问-1
扩增曲线.jpg


关于荧光定量PCR扩增曲线的疑问-2
溶解曲线.jpg
赞一下(3人) 回复此楼
将欲取之必先与之
2楼2014-06-28 10:40:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Beryl_xu

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-06-28 10:40:49
Real Time PCR根据其原理，可以在PCR体系里加入荧光染料或者用特异性的荧光探针。我经常用的是前者，你的应该也是。
荧光染料法，对引物的要求还是挺高的，根据你的扩增曲线，排除加样过程中的误差，我认为 你的引 ...

做qPCR时候，设计引物之后，最好是要验证引物的非特异性（只有一个峰的溶解曲线），才能开始正式试验吧？
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2014-06-28 13:07:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

茂林修竹7

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Beryl_xu at 2014-06-28 13:07:40
做qPCR时候，设计引物之后，最好是要验证引物的非特异性（只有一个峰的溶解曲线），才能开始正式试验吧？...

是的。
回复此楼
将欲取之必先与之
4楼2014-06-28 20:12:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhpu2008

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-06-28 10:40:49
Real Time PCR根据其原理，可以在PCR体系里加入荧光染料或者用特异性的荧光探针。我经常用的是前者，你的应该也是。
荧光染料法，对引物的要求还是挺高的，根据你的扩增曲线，排除加样过程中的误差，我认为 你的引 ...

谢谢回复，溶解曲线都是单一的峰，只是扩增曲线异常，不知是何原因
赞一下 回复此楼
5楼2014-06-29 20:30:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

茂林修竹7

金虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-07-15 15:55:31
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhpu2008 at 2014-06-29 20:30:08
谢谢回复，溶解曲线都是单一的峰，只是扩增曲线异常，不知是何原因...

那就要考虑 反转录ｃＤＮＡ的质量和浓度了，我做Ｒｅａｌｔｉｍｅ是ｃＤＮＡ一般使用量是　１００－２００ｎｇ／孔（拟南芥材料）
赞一下(2人) 回复此楼
将欲取之必先与之
6楼2014-06-30 07:57:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

taccycle

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 15:55:39
依我看这个图是因为背景循环数和阈值设置的不好，你尝试更改一下阈值线和背景循环数看看
赞一下(2人) 回复此楼
用心
7楼2014-07-01 15:19:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mumu1990

铜虫 (初入文坛)
你好，你的问题解决了吗？我最近做定量也出现了这个问题，想请教一下原因
赞一下 回复此楼
8楼2014-08-08 17:16:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

周硕

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by mumu1990 at 2014-08-08 17:16:53
你好，你的问题解决了吗？我最近做定量也出现了这个问题，想请教一下原因

应该是这个基因的表达量太高了，建议再加大cDNA的稀释倍数。
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2014-10-11 09:13:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qq693989099

新虫 (初入文坛)
楼主问题最后怎么解决的啊
赞一下 回复此楼
10楼2015-10-19 09:30:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zhpu2008 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 285求调剂 +4 mapmath 2026-04-06 4/200 2026-04-06 15:15 by 自强2019
[考研] 308求调剂 +13 倘若起风了呢 2026-04-05 13/650 2026-04-06 14:20 by 蒋皓禹
[考研] 08600生物与医药-327 +8 18755400796 2026-04-05 8/400 2026-04-06 11:59 by lijunpoly
[考研] 求调剂 +11 xzghyuj 2026-04-04 11/550 2026-04-06 11:49 by lijunpoly
[考研] 一志愿武汉理工大学080200机械工程308分，求调剂 +4 终不似从前 2026-04-05 4/200 2026-04-06 11:46 by 考研学校招点人
[考研] 一志愿211，化学学硕，310分，本科重点双非，求调剂 +13 努力奋斗112 2026-04-04 13/650 2026-04-06 07:13 by jj987
[考研] 085602调剂 初试总分335 +9 19123253302 2026-04-05 9/450 2026-04-06 06:14 by houyaoxu
[考研] 复试调剂 +8 春日来信- 2026-04-03 8/400 2026-04-05 18:58 by 蓝云思雨
[有机交流] 甲醇/二氯 1:15过柱子 5+3 a哎y呦w喂 2026-03-31 3/150 2026-04-05 10:42 by 88817753
[考研] 290求调剂 +7 luoziheng 2026-04-04 7/350 2026-04-04 23:17 by lqwchd
[考研] 349求调剂 +11 zwjjjjjj 2026-03-31 11/550 2026-04-04 19:52 by 蓝云思雨
[考研] 085701求调剂 +7 龚禹铭 2026-04-04 8/400 2026-04-04 13:49 by 小小树2024
[考研] 309求调剂 +6 刘刘刘1231 2026-04-02 7/350 2026-04-04 13:41 by liucky
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +5 崔wj 2026-04-03 5/250 2026-04-03 15:06 by arrow8852
[考研] 366求调剂一志愿东北大学 +8 运气来得若有似� 2026-04-02 8/400 2026-04-02 21:39 by dongzh2009
[考研] 293求调剂 +4 珂珂乐 2026-04-02 4/200 2026-04-02 20:10 by 6781022
[考研] 土木304求调剂 +6 兔突突突， 2026-03-31 7/350 2026-04-02 09:06 by coolminer
[考研] 求调剂，一志愿北林食品与营养095500，301分，已过六级，有科研经历 +4 快乐储蓄罐 2026-03-31 4/200 2026-04-01 09:26 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 生物学 377分 +6 zzll03 2026-03-31 6/300 2026-03-31 17:33 by 唐沐儿
[考研] 吉大生物学326分求调剂 +3 sunnyupup 2026-03-31 3/150 2026-03-31 09:28 by longlotian
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭