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zhpu2008

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于荧光定量PCR扩增曲线的疑问 已有3人参与

各位大侠好，近两天做荧光定量PCR，但扩增曲线，有的正常，有的不正常，甚至是三个重复里面就差别较大，深蓝色是3个重复，浅蓝色是3个重复，有图附上，大家看看，帮忙分析原因，谢谢！

关于荧光定量PCR扩增曲线的疑问
quxian.jpg
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1楼 2014-06-28 09:10:54
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茂林修竹7

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
zhpu2008(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励回帖交流 2014-06-28 13:05:06
Real Time PCR根据其原理，可以在PCR体系里加入荧光染料或者用特异性的荧光探针。我经常用的是前者，你的应该也是。
荧光染料法，对引物的要求还是挺高的，根据你的扩增曲线，排除加样过程中的误差，我认为 你的引物不好。
建议你做Relatime之前，最好先把引物检测一下。Relatime检测，就是一个引物准备两个上样孔，A.正常加样；B.把cDNA换成定量的H2O，看溶解曲线。好的引物溶解曲线，A孔只有一个峰，B孔没有峰。
另外加样的时候，最好混合一个体系，计算好用量，一个孔一个孔的分装，微量的如引物最好不要单独加，这样误差很大的。
图片是我做的，你可以参考下。
关于荧光定量PCR扩增曲线的疑问-1
扩增曲线.jpg


关于荧光定量PCR扩增曲线的疑问-2
溶解曲线.jpg
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将欲取之必先与之
2楼2014-06-28 10:40:49
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Beryl_xu

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-06-28 10:40:49
Real Time PCR根据其原理，可以在PCR体系里加入荧光染料或者用特异性的荧光探针。我经常用的是前者，你的应该也是。
荧光染料法，对引物的要求还是挺高的，根据你的扩增曲线，排除加样过程中的误差，我认为 你的引 ...

做qPCR时候，设计引物之后，最好是要验证引物的非特异性（只有一个峰的溶解曲线），才能开始正式试验吧？
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3楼2014-06-28 13:07:40
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茂林修竹7

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Beryl_xu at 2014-06-28 13:07:40
做qPCR时候，设计引物之后，最好是要验证引物的非特异性（只有一个峰的溶解曲线），才能开始正式试验吧？...

是的。
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将欲取之必先与之
4楼2014-06-28 20:12:56
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zhpu2008

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-06-28 10:40:49
Real Time PCR根据其原理，可以在PCR体系里加入荧光染料或者用特异性的荧光探针。我经常用的是前者，你的应该也是。
荧光染料法，对引物的要求还是挺高的，根据你的扩增曲线，排除加样过程中的误差，我认为 你的引 ...

谢谢回复，溶解曲线都是单一的峰，只是扩增曲线异常，不知是何原因
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5楼2014-06-29 20:30:08
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茂林修竹7

金虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-07-15 15:55:31
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhpu2008 at 2014-06-29 20:30:08
谢谢回复，溶解曲线都是单一的峰，只是扩增曲线异常，不知是何原因...

那就要考虑 反转录ｃＤＮＡ的质量和浓度了，我做Ｒｅａｌｔｉｍｅ是ｃＤＮＡ一般使用量是　１００－２００ｎｇ／孔（拟南芥材料）
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将欲取之必先与之
6楼2014-06-30 07:57:33
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taccycle

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 15:55:39
依我看这个图是因为背景循环数和阈值设置的不好，你尝试更改一下阈值线和背景循环数看看
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用心
7楼2014-07-01 15:19:17
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mumu1990

铜虫 (初入文坛)
你好，你的问题解决了吗？我最近做定量也出现了这个问题，想请教一下原因
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8楼2014-08-08 17:16:53
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周硕

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by mumu1990 at 2014-08-08 17:16:53
你好，你的问题解决了吗？我最近做定量也出现了这个问题，想请教一下原因

应该是这个基因的表达量太高了，建议再加大cDNA的稀释倍数。
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9楼2014-10-11 09:13:37
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qq693989099

新虫 (初入文坛)
楼主问题最后怎么解决的啊
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10楼2015-10-19 09:30:34
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