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zhpu2008铜虫 (小有名气)
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[求助]
关于荧光定量PCR扩增曲线的疑问已有3人参与
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各位大侠好，近两天做荧光定量PCR，但扩增曲线，有的正常，有的不正常，甚至是三个重复里面就差别较大，深蓝色是3个重复，浅蓝色是3个重复，有图附上，大家看看，帮忙分析原因，谢谢！ quxian.jpg |
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4楼2014-06-28 20:12:56
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
zhpu2008(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励回帖交流 2014-06-28 13:05:06
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
zhpu2008(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励回帖交流 2014-06-28 13:05:06
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Real Time PCR根据其原理，可以在PCR体系里加入荧光染料或者用特异性的荧光探针。我经常用的是前者，你的应该也是。 荧光染料法，对引物的要求还是挺高的，根据你的扩增曲线，排除加样过程中的误差，我认为 你的引物不好。 建议你做Relatime之前，最好先把引物检测一下。Relatime检测，就是一个引物准备两个上样孔，A.正常加样；B.把cDNA换成定量的H2O，看溶解曲线。好的引物溶解曲线，A孔只有一个峰，B孔没有峰。 另外加样的时候，最好混合一个体系，计算好用量，一个孔一个孔的分装，微量的如引物最好不要单独加，这样误差很大的。 图片是我做的，你可以参考下。  扩增曲线.jpg  溶解曲线.jpg |
2楼2014-06-28 10:40:49
3楼2014-06-28 13:07:40
zhpu2008
铜虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
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- 帖子: 83
- 在线: 15.8小时
- 虫号: 650826
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- 性别: GG
- 专业: 兽医传染病学
5楼2014-06-29 20:30:08