应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于荧光定量PCR扩增曲线的疑问
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
101/1返回列表
查看: 2154  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zhpu2008

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于荧光定量PCR扩增曲线的疑问 已有3人参与

各位大侠好，近两天做荧光定量PCR，但扩增曲线，有的正常，有的不正常，甚至是三个重复里面就差别较大，深蓝色是3个重复，浅蓝色是3个重复，有图附上，大家看看，帮忙分析原因，谢谢！

关于荧光定量PCR扩增曲线的疑问
quxian.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-06-28 09:10:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

茂林修竹7

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
zhpu2008(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励回帖交流 2014-06-28 13:05:06
Real Time PCR根据其原理，可以在PCR体系里加入荧光染料或者用特异性的荧光探针。我经常用的是前者，你的应该也是。
荧光染料法，对引物的要求还是挺高的，根据你的扩增曲线，排除加样过程中的误差，我认为 你的引物不好。
建议你做Relatime之前，最好先把引物检测一下。Relatime检测，就是一个引物准备两个上样孔，A.正常加样；B.把cDNA换成定量的H2O，看溶解曲线。好的引物溶解曲线，A孔只有一个峰，B孔没有峰。
另外加样的时候，最好混合一个体系，计算好用量，一个孔一个孔的分装，微量的如引物最好不要单独加，这样误差很大的。
图片是我做的，你可以参考下。
关于荧光定量PCR扩增曲线的疑问-1
扩增曲线.jpg


关于荧光定量PCR扩增曲线的疑问-2
溶解曲线.jpg
赞一下(3人) 回复此楼
将欲取之必先与之
2楼2014-06-28 10:40:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Beryl_xu

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-06-28 10:40:49
Real Time PCR根据其原理，可以在PCR体系里加入荧光染料或者用特异性的荧光探针。我经常用的是前者，你的应该也是。
荧光染料法，对引物的要求还是挺高的，根据你的扩增曲线，排除加样过程中的误差，我认为 你的引 ...

做qPCR时候，设计引物之后，最好是要验证引物的非特异性（只有一个峰的溶解曲线），才能开始正式试验吧？
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2014-06-28 13:07:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

茂林修竹7

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Beryl_xu at 2014-06-28 13:07:40
做qPCR时候，设计引物之后，最好是要验证引物的非特异性（只有一个峰的溶解曲线），才能开始正式试验吧？...

是的。
回复此楼
将欲取之必先与之
4楼2014-06-28 20:12:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhpu2008

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-06-28 10:40:49
Real Time PCR根据其原理，可以在PCR体系里加入荧光染料或者用特异性的荧光探针。我经常用的是前者，你的应该也是。
荧光染料法，对引物的要求还是挺高的，根据你的扩增曲线，排除加样过程中的误差，我认为 你的引 ...

谢谢回复，溶解曲线都是单一的峰，只是扩增曲线异常，不知是何原因
赞一下 回复此楼
5楼2014-06-29 20:30:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

茂林修竹7

金虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-07-15 15:55:31
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhpu2008 at 2014-06-29 20:30:08
谢谢回复，溶解曲线都是单一的峰，只是扩增曲线异常，不知是何原因...

那就要考虑 反转录ｃＤＮＡ的质量和浓度了，我做Ｒｅａｌｔｉｍｅ是ｃＤＮＡ一般使用量是　１００－２００ｎｇ／孔（拟南芥材料）
赞一下(2人) 回复此楼
将欲取之必先与之
6楼2014-06-30 07:57:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

taccycle

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 15:55:39
依我看这个图是因为背景循环数和阈值设置的不好，你尝试更改一下阈值线和背景循环数看看
赞一下(2人) 回复此楼
用心
7楼2014-07-01 15:19:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mumu1990

铜虫 (初入文坛)
你好，你的问题解决了吗？我最近做定量也出现了这个问题，想请教一下原因
赞一下 回复此楼
8楼2014-08-08 17:16:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

周硕

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by mumu1990 at 2014-08-08 17:16:53
你好，你的问题解决了吗？我最近做定量也出现了这个问题，想请教一下原因

应该是这个基因的表达量太高了，建议再加大cDNA的稀释倍数。
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2014-10-11 09:13:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qq693989099

新虫 (初入文坛)
楼主问题最后怎么解决的啊
赞一下 回复此楼
10楼2015-10-19 09:30:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zhpu2008 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 343求调剂 +5 爱羁绊 2026-03-28 5/250 2026-03-28 20:53 by 唐沐儿
[考研] 一志愿北化085600材料专硕275|有文章专利｜求调剂 +7 Micky11223 2026-03-25 7/350 2026-03-28 18:34 by 无际的草原
[考研] 化学0703 调剂 306分 一志愿211 +4 26要上岸 2026-03-28 4/200 2026-03-28 15:30 by 1018329917
[考研] 346求调剂 一志愿070303有机化学 +3 萝卜炖青菜 2026-03-28 3/150 2026-03-28 14:11 by 唐沐儿
[考研] 0703化学 +10 妮妮ninicgb 2026-03-27 10/500 2026-03-28 14:07 by 哒哒哒呱呱呱
[考研] 283求调剂 +7 A child 2026-03-28 7/350 2026-03-28 12:05 by zllcz
[考研] 一志愿南昌大学324求调剂 +7 hanamiko 2026-03-27 7/350 2026-03-28 09:56 by 李上岸0921
[考研] 求调剂 +8 张zz111 2026-03-27 9/450 2026-03-28 03:41 by fmesaito
[有机交流] 高温高压反应求助 10+4 chibby 2026-03-25 4/200 2026-03-27 21:08 by BT20230424
[考研] 272求调剂 +7 脚滑的守法公民 2026-03-27 7/350 2026-03-27 17:23 by laoshidan
[考研] 0703化学一志愿南京师范大学303求调剂 +3 zzffylgg 2026-03-24 3/150 2026-03-27 10:42 by shangxh
[考研] 一志愿吉大071010，316分求调剂 +3 xgbiknn 2026-03-27 3/150 2026-03-27 10:36 by guoweigw
[考研] 286求调剂 +4 lim0922 2026-03-26 4/200 2026-03-27 10:28 by guoweigw
[考研] 材料学硕333求调剂 +8 北道巷 2026-03-24 8/400 2026-03-27 10:18 by 我是小康
[考研] 294分080500材料科学与工程求调剂 +4 柳溪边 2026-03-26 4/200 2026-03-26 21:14 by XPU李庆
[考研] 一志愿哈工大，085400，320，求调剂 +4 gdlf9999 2026-03-24 4/200 2026-03-25 23:01 by boxking200
[考研] 一志愿中南大学化学学硕0703总分337求调剂 +7 niko- 2026-03-22 7/350 2026-03-25 20:14 by qingfeng258
[考研] 340求调剂 +5 话梅糖111 2026-03-24 5/250 2026-03-25 06:53 by ilovexiaobin
[有机交流] 有机合成求助 20+3 FENGSHUJEI 2026-03-23 5/250 2026-03-24 19:31 by 88817753
[考研] 材料专硕331求调剂 +4 鲜当牛 2026-03-24 4/200 2026-03-24 15:58 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭