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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR标准曲线有问题 乱飞
汕头大学海洋科学接受调剂
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紫衫月影

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR标准曲线有问题 乱飞

今天跑得标准曲线结果，大虾们看看是什么原因！
荧光定量PCR标准曲线有问题 乱飞
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1楼 2013-08-25 16:32:06
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-25 22:37:55
紫衫月影: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢啦，我今天跑跑再试试 2013-08-26 11:04:16
1、从溶解曲线上看，都在一个点发生，排除了引物的问题。
2、不是引物问题就是楼主的加样方法有问题。
3、标准曲线的做法是以10倍作为稀释倍数进行，所以再加样时提高精确度，通常都是分装的办法。如：每个浓度做三个管，共做5个浓度，10倍稀释。则你要准备4个管的量。第一个最大浓度混合完毕后分装到体积相同三个管中，第四个管进行稀释，然后再分装。以此类推。
4、不论你怎么加样，一定要总的开始分的结束。
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2楼2013-08-25 18:50:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-08-26 18:36:40
熔解峰单一正常，说明引物没有问题，没有引物二聚体和非特异扩增。从扩增曲线上看，CT值偏小，说明模板浓度太高了。应该把模板稀释到CT值在15-30。扩增曲线的平台期荧光差别大，并且重复样品间不平行，很可能是移液操作的问题。
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3楼2013-08-25 23:28:10
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紫衫月影

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by qingyuansw20 at 2013-08-25 18:50:33
1、从溶解曲线上看，都在一个点发生，排除了引物的问题。
2、不是引物问题就是楼主的加样方法有问题。
3、标准曲线的做法是以10倍作为稀释倍数进行，所以再加样时提高精确度，通常都是分装的办法。如：每个浓度做 ...

今天的结果，这又是怎么回事？R2=0.斜率=0~~~请教大侠
荧光定量PCR标准曲线有问题 乱飞-1
QQ截图20000826143753.png


荧光定量PCR标准曲线有问题 乱飞-2
QQ截图20000826143845.png
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4楼2013-08-26 14:42:13
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紫衫月影

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-25 23:28:10
熔解峰单一正常，说明引物没有问题，没有引物二聚体和非特异扩增。从扩增曲线上看，CT值偏小，说明模板浓度太高了。应该把模板稀释到CT值在15-30。扩增曲线的平台期荧光差别大，并且重复样品间不平行，很可能是移液 ...

今天我跑了的结果，这又是怎么回事？R2=0.斜率=0~~~请教大侠
荧光定量PCR标准曲线有问题 乱飞-3
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荧光定量PCR标准曲线有问题 乱飞-4
QQ截图20000826143845.png
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5楼2013-08-26 14:43:40
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 紫衫月影 at 2013-08-26 14:43:40
今天我跑了的结果，这又是怎么回事？R2=0.斜率=0~~~请教大侠

QQ截图20000826143753.png

QQ截图20000826143845.png
...

你确定做图时正确标记了样品的释度？
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6楼2013-08-26 14:53:52
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-08-26 18:37:22
引用回帖:
4楼: Originally posted by 紫衫月影 at 2013-08-26 14:42:13
今天的结果，这又是怎么回事？R2=0.斜率=0~~~请教大侠

QQ截图20000826143753.png

QQ截图20000826143845.png
...

今天挺好跑的挺好。从图上看很perfect。求斜率方法：直接在软解上取点生成。每个软件操作不一样，你要问问你身边的同学。没条件可以抄回ct值，在excell表上生成曲线，看斜率。
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7楼2013-08-26 16:16:21
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niil

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 紫衫月影 at 2013-08-26 14:43:40
今天我跑了的结果，这又是怎么回事？R2=0.斜率=0~~~请教大侠

QQ截图20000826143753.png

QQ截图20000826143845.png
...

要在软件里设置好了每个梯度的相对浓度才能做出标准曲线。你的标准曲线是一条竖线，肯定是没有设置的原因了。
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Stop fighting,let it flow.
8楼2013-08-27 10:58:51
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张扬令狐葱

新虫 (初入文坛)
楼主您好，我想问下，您第二次做的扩增曲线明显变好了，相对于第一次，您是怎么改进的？
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寻找
9楼2019-08-16 09:16:20
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