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汕头大学海洋科学接受调剂
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紫衫月影

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR标准曲线有问题 乱飞

今天跑得标准曲线结果,大虾们看看是什么原因!
荧光定量PCR标准曲线有问题 乱飞
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-25 22:37:55
紫衫月影: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢啦,我今天跑跑再试试 2013-08-26 11:04:16
1、从溶解曲线上看,都在一个点发生,排除了引物的问题。
2、不是引物问题就是楼主的加样方法有问题。
3、标准曲线的做法是以10倍作为稀释倍数进行,所以再加样时提高精确度,通常都是分装的办法。如:每个浓度做三个管,共做5个浓度,10倍稀释。则你要准备4个管的量。第一个最大浓度混合完毕后分装到体积相同三个管中,第四个管进行稀释,然后再分装。以此类推。
4、不论你怎么加样,一定要总的开始分的结束。
2楼2013-08-25 18:50:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助! 2013-08-26 18:36:40
熔解峰单一正常,说明引物没有问题,没有引物二聚体和非特异扩增。从扩增曲线上看,CT值偏小,说明模板浓度太高了。应该把模板稀释到CT值在15-30。扩增曲线的平台期荧光差别大,并且重复样品间不平行,很可能是移液操作的问题。
3楼2013-08-25 23:28:10
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紫衫月影

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by qingyuansw20 at 2013-08-25 18:50:33
1、从溶解曲线上看,都在一个点发生,排除了引物的问题。
2、不是引物问题就是楼主的加样方法有问题。
3、标准曲线的做法是以10倍作为稀释倍数进行,所以再加样时提高精确度,通常都是分装的办法。如:每个浓度做 ...

今天的结果,这又是怎么回事?R2=0.斜率=0~~~请教大侠
荧光定量PCR标准曲线有问题 乱飞-1
QQ截图20000826143753.png


荧光定量PCR标准曲线有问题 乱飞-2
QQ截图20000826143845.png

4楼2013-08-26 14:42:13
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紫衫月影

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-25 23:28:10
熔解峰单一正常,说明引物没有问题,没有引物二聚体和非特异扩增。从扩增曲线上看,CT值偏小,说明模板浓度太高了。应该把模板稀释到CT值在15-30。扩增曲线的平台期荧光差别大,并且重复样品间不平行,很可能是移液 ...

今天我跑了的结果,这又是怎么回事?R2=0.斜率=0~~~请教大侠
荧光定量PCR标准曲线有问题 乱飞-3
QQ截图20000826143753.png


荧光定量PCR标准曲线有问题 乱飞-4
QQ截图20000826143845.png

5楼2013-08-26 14:43:40
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 紫衫月影 at 2013-08-26 14:43:40
今天我跑了的结果,这又是怎么回事?R2=0.斜率=0~~~请教大侠

QQ截图20000826143753.png

QQ截图20000826143845.png
...

你确定做图时正确标记了样品的释度?
6楼2013-08-26 14:53:52
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流! 2013-08-26 18:37:22
引用回帖:
4楼: Originally posted by 紫衫月影 at 2013-08-26 14:42:13
今天的结果,这又是怎么回事?R2=0.斜率=0~~~请教大侠

QQ截图20000826143753.png

QQ截图20000826143845.png
...

今天挺好跑的挺好。从图上看很perfect。求斜率方法:直接在软解上取点生成。每个软件操作不一样,你要问问你身边的同学。没条件可以抄回ct值,在excell表上生成曲线,看斜率。
7楼2013-08-26 16:16:21
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niil

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 紫衫月影 at 2013-08-26 14:43:40
今天我跑了的结果,这又是怎么回事?R2=0.斜率=0~~~请教大侠

QQ截图20000826143753.png

QQ截图20000826143845.png
...

要在软件里设置好了每个梯度的相对浓度才能做出标准曲线。你的标准曲线是一条竖线,肯定是没有设置的原因了。
Stop fighting,let it flow.
8楼2013-08-27 10:58:51
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张扬令狐葱

新虫 (初入文坛)

楼主您好,我想问下,您第二次做的扩增曲线明显变好了,相对于第一次,您是怎么改进的?
寻找
9楼2019-08-16 09:16:20
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