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李英英

铁虫 (初入文坛)

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[交流] 测序公司说浓度太低，取消测序是什么情况？

这是我做完挑菌，PCR后跑的电泳的图片，然后用PCR产物拿去测序，测序公司说浓度太低测不了，那我应该怎么改进

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2014-06-16 21:07:47, 3.66 M

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1楼 2014-06-16 21:10:51

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雨中的雕塑

银虫 (小有名气)

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我愿天下人：人人得以智慧之光，去开启生命之真谛

2楼2014-06-17 08:18:50

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liyu0355

木虫 (正式写手)

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李英英(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-06-20 16:45:53

菌液：
  请您最好提供200 µl 以上新鲜菌液，装在1.5 ml离心管中并用封口膜封好交给我们的工作人员或快递邮寄，或者提供4ml新鲜菌液，我们可直接进行质粒的提取。
  我们的常规培养基为LB，培养温度为37℃，常规抗生素为氨卞青霉素、卡那霉素、氯霉素。您的样品如果需要特殊培养要求,请您提供4ml新鲜菌液；如果使用特殊抗生素，请您一定提供储存液并告知浓度以及工作浓度。除此之外，您还可以提供平板菌、穿刺菌或者甘油菌。

质粒：
  如果您的质粒纯度可以达到全自动测序的要求，即：OD260/OD280=1.6-2.0，也可以直接提供质粒。要求浓度要求>200ng/µl，提供10 µl 以上。
  我们的常规培养基为LB，培养温度为37℃，常规抗生素为氨卞青霉素、卡那霉素、氯霉素。您的样品如果需要特殊培养要求,请您提供4ml新鲜菌液；如果使用特殊抗生素，请您一定提供储存液并告知浓度以及工作浓度。除此之外，您还可以提供平板菌、穿刺菌或者甘油菌。以下情况请您直接提供抽提好的DNA模板：
1. 噬菌体DNA
2. 低拷贝质粒
3. cosmid,BAC DNA
  请您纯化DNA模板时注意：纯化的DNA模板要求纯度高。纯化以后的DNA模板要溶解于无菌去离子水。浓度要求>200ng/µl，(载体较大的，请提供>500ng/µl)，提供10µl以上(一般情况下，经测序部检测合格后才可使用)。
  无论您按照1或2提供菌液或质粒，请您务必写明：
1. 质粒的名称和详细图谱
2. 插入片段的大小和酶切位点
3. 选取的测序引物名称和序列，并且标明测序引物距离插入片段的位置(注：测序引物以后可能会有20-30个碱基不明晰)
4. 如果提供特殊测序引物，请写明序列，并且一定要提供经PAGE纯化的引物，浓度大于5pmol/µl

PCR产物：
  如果您提供的是PCR原液，我们将进行琼脂糖凝胶电泳纯化。回收后的产物无论测序成功与否，我们将收取一定的纯化费用，所以请您提供PCR原液时一定要进行鉴定。确信PCR产物为单一扩增条带，总量必须大于2µg，方可提供，以免耽搁您的实验。
  如果您提供纯化好的PCR产物，条带必须单一，纯度OD260/OD280=1.6-2.0。最好溶解在灭过菌的去离子水中，浓度要求>50 ng/µl，提供10µl以上。同时请您提供PCR引物，并注明浓度，一定要提供经PAGE纯化的引物，浓度大于5pmol/µl。
  注意事项：
1. PCR产物直接测序成功的关键是PCR产物的纯度，所以我们提倡切胶回收PCR产物。如果有几条PCR产物长度相近，用电泳胶也无法分开，此时的PCR产物便无法直接测序。这种情况建议把PCR产物克隆后测序。
2. PCR产物直接测序成功的另一要因是引物，不能做PCR反应的引物便能测序。测序用引物要求较高，引物的3’端必须与模板完全其配，含有Mix碱基的引物一般不能测序（特别是3’端）。此外，测序引物长度一般为20个碱基左右，GC含量必须在50－60％左右。而且用于测序的引物一定要经过PAGE纯化，纯度必须大于90％。
3. 在PCR扩增时，难以扩增（扩增后的PCR带较弱）的PCR产物在测序时一般成功率较低。
4. 小于150bp的PCR产物直接测序效果不好，建议克隆后测序。

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3楼2014-06-17 11:35:18

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