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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 引物设计保护碱基的选择
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hero352

金虫 (小有名气)

[求助] 引物设计保护碱基的选择 已有4人参与

上游 保护碱基 GCTTGGAC     CATATG  nde1
下游  保护碱基CGCG    CTCGAG  xho
最近一直做基因克隆，可是载体和目的片段一直连不上，大家帮我看看是不是引物设计时保护碱基选不的合适，是不是切不开啊，酶切位点分别是NDE1和XHO1
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1楼 2014-06-11 21:44:52
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-06-11 23:36:39
你可以把片段连在t载体上，再切下来，不必加保护碱基

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2楼2014-06-11 22:17:42
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 我们一般是3个，没发现有太大的什么问题 2014-06-11 23:38:30
XhoI加3个保护碱基切20h效率约为75%，我一般都是加6个保护碱基。而且XhoI4个位点的连接效率低于其他位点，一般都是要长时间连接的。
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大家相互帮助哈
3楼2014-06-11 22:59:36
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匿名

用户注销 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖仅楼主可见
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4楼2014-06-12 09:55:25
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hero352

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-11 22:17:42
你可以把片段连在t载体上，再切下来，不必加保护碱基

我是高保真酶PCR，不能直接连T载体，如果PCR产物加A的话，不知道效率高不高
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5楼2014-06-12 21:36:35
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hero352

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-11 22:59:36
XhoI加3个保护碱基切20h效率约为75%，我一般都是加6个保护碱基。而且XhoI4个位点的连接效率低于其他位点，一般都是要长时间连接的。

切的时间太长会不会对DNA有影响啊，我以前用宝生物的常规酶一般也就切8个小时，明天准备换fermentase快酶来切，不知道切多长时间呢，说明书上似乎时间都很短
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6楼2014-06-12 21:41:34
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by hero352 at 2014-06-12 21:36:35
我是高保真酶PCR，不能直接连T载体，如果PCR产物加A的话，不知道效率高不高...

你这两种选择效率都不高

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7楼2014-06-12 22:03:49
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hero352 at 2014-06-12 21:41:34
切的时间太长会不会对DNA有影响啊，我以前用宝生物的常规酶一般也就切8个小时，明天准备换fermentase快酶来切，不知道切多长时间呢，说明书上似乎时间都很短...

如果37度切8个小时我没试过，你切完检测过条带没，我37度最多切过5个小时，该切开的早就切开了。XhoI那4个位点的连接效率不太高，你连接体系怎么样？转化了后是没有转化子还是很多的假阳性？
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大家相互帮助哈
8楼2014-06-12 22:14:28
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愚者517

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没有连上，一定是酶切问题，跑一下琼脂糖电泳看看，是否有三条带。
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9楼2014-06-13 08:57:22
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