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hero352

金虫 (小有名气)

[求助] 引物设计保护碱基的选择 已有4人参与

上游 保护碱基 GCTTGGAC     CATATG  nde1
下游  保护碱基CGCG    CTCGAG  xho
最近一直做基因克隆,可是载体和目的片段一直连不上,大家帮我看看是不是引物设计时保护碱基选不的合适,是不是切不开啊,酶切位点分别是NDE1和XHO1
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luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by hero352 at 2014-06-12 21:41:34
切的时间太长会不会对DNA有影响啊,我以前用宝生物的常规酶一般也就切8个小时,明天准备换fermentase快酶来切,不知道切多长时间呢,说明书上似乎时间都很短...

如果37度切8个小时我没试过,你切完检测过条带没,我37度最多切过5个小时,该切开的早就切开了。XhoI那4个位点的连接效率不太高,你连接体系怎么样?转化了后是没有转化子还是很多的假阳性?
大家相互帮助哈
8楼2014-06-12 22:14:28
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-06-11 23:36:39
你可以把片段连在t载体上,再切下来,不必加保护碱基

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-06-11 22:17:42
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 我们一般是3个,没发现有太大的什么问题 2014-06-11 23:38:30
XhoI加3个保护碱基切20h效率约为75%,我一般都是加6个保护碱基。而且XhoI4个位点的连接效率低于其他位点,一般都是要长时间连接的。
大家相互帮助哈
3楼2014-06-11 22:59:36
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匿名

用户注销 (正式写手)

感谢参与,应助指数 +1
本帖仅楼主可见
4楼2014-06-12 09:55:25
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