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一路向前看

铁虫 (初入文坛)

[交流] western blot出现多条带是什么原因

一抗是兔多抗，稀释度1:800；二抗1:3000，上样大约40ug，TBST洗膜3*10min，结果如图出现明显三条带（大约110、100、85KD），另外还有些微弱的条带，这个蛋白目前没人做过，预测的分子量是63kd，实际分子量未见报道，请问这是什么原因造成的？是蛋白量太大？抗体浓度太高？应该选用哪一条带？求高手解答

western blot出现多条带是什么原因
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1楼 2014-06-11 09:26:17
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kiss20085537
★
一路向前看(金币+1): 谢谢参与
2楼2014-06-11 09:43:03
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ansonal
★
一路向前看(金币+1): 谢谢参与
3楼2014-06-11 09:45:39
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Rubisco580

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
多抗特异性差，是可能出杂带的。一般主带比杂带深，但我也碰到过杂带深的……
上样量不算很大，我常用50ug。
可以试试一抗再稀一些或者用封闭用的牛奶来配，据说这样会减少杂带。
对你的实验不了解，用哪条带还得楼主自己多加分析
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4楼2014-06-11 11:26:35
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
分子量最接近的那条带可能性最大，有时候多克隆抗体的杂带还是很明显滴
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5楼2014-06-11 12:23:21
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shilei916511

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可能是蛋白变性不彻底，建议煮蛋白时间长点，另外感觉胶也有些问题。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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我懂我的偏执，默不作声或冷漠是我最大的容忍。
6楼2014-06-13 17:06:25
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风从影动
7楼2014-06-14 11:30:09
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可能原因：
1.封闭不好。5%脱脂奶粉或者3%BSA或质量不好，或者用量不足，或者时间不够等。
2.一抗的浓度过大，引起抗体与非抗体的特异性识别的抗原也发生了一定程度上的相互作用，这时洗膜是洗不下去的。
3.抗体质量不高。至少一抗应该用单克隆抗体，其识别的抗原免疫簇位点不是唯一的。而一抗若为多克隆抗体，则是是一群抗体的组合，因为多克隆抗体的识别的抗原免疫簇位点不是唯一的，一抗可能与非目的抗原也会存在抗原识别。
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8楼2014-07-07 23:29:02
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yanjunyan

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
首先上样量可以，一般比较好做的蛋白40-50微克就可以了。一抗是多抗，会影响条带，因为特异性很差。再就是转膜的时候把条带剪窄一些，只覆盖目的条带的范围。还有就是建议用湿法转膜，效率高，效果好。可以试一下哈。
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在平淡中给自己一个动力，在昂扬中留给自己一份淡泊，在匆忙中让心灵得到释放，在喧闹中找寻一片宁静的天空。
9楼2014-08-23 10:27:50
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