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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

[求助] Western-blot 实验的目的条带 已有3人参与

各位老师,师兄师姐,最近做Western-blot实验,发现目的条带总是大于预测的大小,大致大0.3-0.5kDa左右,急切求解。是什么原因导致的呢,单抗是公司做的,抗原表位也没有错误。还有有师姐说可能是糖基化造成的,去除糖基化后,目的条带会变小至预测大小;我分析了一下大致有两个糖基化位点,这有可能吗?望各位大虾指教,谢谢啦
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没有人生来洒脱,都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
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qianjinyu

铜虫 (初入文坛)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
理论分子量和实际分子量(表观)差一点正常
2楼2014-06-06 09:59:59
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by qianjinyu at 2014-06-06 09:59:59
理论分子量和实际分子量(表观)差一点正常

不是呀,写错啦,大致大了3kDa左右,分析了一下,糖基化位点两个,磷酸化位点好多!
没有人生来洒脱,都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
3楼2014-06-06 10:18:49
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

不好意思啊,写错啦,大致大3kDa左右。
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4楼2014-06-06 10:20:23
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
蛋白质修饰是有可能的,不一定是糖基化。我的蛋白比预计大22 kDa,一直不知道为什么。
5楼2014-06-06 10:29:06
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
一种可能是蛋白变性不彻底,所以条带差异,这种可能性比较小
而更大的可能性是蛋白质修饰的结果,最常见的是糖基化修饰
我以前做的western,糖基化修饰多了20多kda。
这是正常情况。
事实上,蛋白质电泳过程,精确的定义大小不现实,3kda的话,可以认为小小的修饰了下。要想确定精确大小,跑质谱
天行健
6楼2014-06-06 10:49:13
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-06-06 10:49:13
一种可能是蛋白变性不彻底,所以条带差异,这种可能性比较小
而更大的可能性是蛋白质修饰的结果,最常见的是糖基化修饰
我以前做的western,糖基化修饰多了20多kda。
这是正常情况。
事实上,蛋白质电泳过程,精 ...

恩,谢谢,师兄指点,看来去糖基化酶暂时不用买了
没有人生来洒脱,都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
7楼2014-06-10 13:32:50
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-06-06 10:49:13
一种可能是蛋白变性不彻底,所以条带差异,这种可能性比较小
而更大的可能性是蛋白质修饰的结果,最常见的是糖基化修饰
我以前做的western,糖基化修饰多了20多kda。
这是正常情况。
事实上,蛋白质电泳过程,精 ...

很想再追问一下,目的条带附近有两条带,这两条是同一个蛋白的可能性大吗?而且相差很小。
Western-blot 实验的目的条带
图片1.jpg

没有人生来洒脱,都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
8楼2014-06-10 13:37:28
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主

内容已删除
天行健
9楼2014-06-10 14:36:32
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-06-10 14:36:32
一般情况下不是,也不排除,如果是组织提取物,这种情况也比较多见。...

那我还想问下一,如果这两个胶点我送去跑质谱大概多少钱?只要测一下氨基酸序列,分子大小大概都在40kDa左右。
没有人生来洒脱,都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
10楼2014-06-12 14:47:06
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