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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 质粒PCR产物片段大小问题
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梧桐柒夕

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[求助] 质粒PCR产物片段大小问题 已有3人参与

质粒为pUC57的大肠杆菌，质粒提取用的是自制试剂盒，经电泳过后确定是pUC57，然后用的是50μl的Taq体系进行的PCR扩增，引物自设的，将产物进行电泳时发现有两种不同的情况。其一是得到了400+的片段（此片段为正常片段），但同时做的相关平行组还得到了6000左右的片段。有没有相关PCR通透者可以解释一下，这个6000左右的片段会产生的原因？以及这个6000的片段是否正常？
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1楼 2014-06-08 16:37:20
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hailunl

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梧桐柒夕: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-06-08 21:48:47
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-28 16:30:18
有非特异性很正常，PCR不能说明问题。
例如，引物特异性不好，或者退火温度过低，延伸时间过长都会出现非特异性条带，
只要有目标条带就可以了。
如果你想再检测，建议提高退火温度，质粒为模板，退火温度高点没事；延伸时间掌控在目标条带范围；另外，模板稀释10倍或50倍。
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2楼2014-06-08 19:11:00
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梧桐柒夕: 金币+5, ★有帮助 2014-06-08 21:53:33
你这个载体多大，是不是转了一圈了？这种事常有

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-06-08 19:35:27
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梧桐柒夕

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2楼: Originally posted by hailunl at 2014-06-08 19:11:00
有非特异性很正常，PCR不能说明问题。
例如，引物特异性不好，或者退火温度过低，延伸时间过长都会出现非特异性条带，
只要有目标条带就可以了。
如果你想再检测，建议提高退火温度，质粒为模板，退火温度高点没 ...

所有条件都是设计好的，已经是最优的了，如上述说的，部分组出现的是正常地，另一组出现的差异性很大，所以，想知道，在这个过程中，出现这么大片段的原因，是想知道，在怎样的情况下会出现这种情况，是所有产物连在一起了么？
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4楼2014-06-08 21:52:47
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梧桐柒夕

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3楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-08 19:35:27
你这个载体多大，是不是转了一圈了？这种事常有

载体是2710bp的。
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5楼2014-06-08 21:53:23
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3楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-08 19:35:27
你这个载体多大，是不是转了一圈了？这种事常有

难道转了两圈？
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6楼2014-06-08 21:53:59
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hailunl

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 梧桐柒夕 at 2014-06-08 21:52:47
所有条件都是设计好的，已经是最优的了，如上述说的，部分组出现的是正常地，另一组出现的差异性很大，所以，想知道，在这个过程中，出现这么大片段的原因，是想知道，在怎样的情况下会出现这种情况，是所有产物连 ...

如果加上目标基因长度只有2.7k，扩出6k的非特异性条带，不可能什么转不转了两圈的。
很有可能是引物，水，或者酶被污染。
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7楼2014-06-08 23:08:12
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hailunl

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
梧桐柒夕: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-06-09 07:28:36
引用回帖:
4楼: Originally posted by 梧桐柒夕 at 2014-06-08 21:52:47
所有条件都是设计好的，已经是最优的了，如上述说的，部分组出现的是正常地，另一组出现的差异性很大，所以，想知道，在这个过程中，出现这么大片段的原因，是想知道，在怎样的情况下会出现这种情况，是所有产物连 ...

很明确告诉你，不可能是所有产物连在一起。什么转了一圈不一圈的，不要相信那些胡言乱语。我最讨厌不懂装懂。
你延伸时间多长扩出6K的片段？你延伸400左右的片段扩出这么长的，不可能转了一圈。
如果你真想找出原因，回收，测序，两端各测一个反应。测序时候把自己引物带上10ul.
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8楼2014-06-08 23:15:46
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梧桐柒夕

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引用回帖:
7楼: Originally posted by hailunl at 2014-06-08 23:08:12
如果加上目标基因长度只有2.7k，扩出6k的非特异性条带，不可能什么转不转了两圈的。
很有可能是引物，水，或者酶被污染。...

被污染的情况应该也可以排除，使用的是同一管混合液。
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9楼2014-06-09 07:27:43
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梧桐柒夕

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8楼: Originally posted by hailunl at 2014-06-08 23:15:46
很明确告诉你，不可能是所有产物连在一起。什么转了一圈不一圈的，不要相信那些胡言乱语。我最讨厌不懂装懂。
你延伸时间多长扩出6K的片段？你延伸400左右的片段扩出这么长的，不可能转了一圈。
如果你真想找出原 ...

好的。多谢～
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10楼2014-06-09 07:29:12
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