应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR片段大小问题
141/2返回列表12下一页
查看: 1699  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

clbb1030

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR片段大小问题 已有5人参与

我从动物组织中分离纯化得到天然蛋白是233个氨基酸，然后在NCBI上找到它的序列，按照NCBI上提供的DNA序列设计引物，加限制性酶切位点。Total RNA为模板RT-PCR得到的片段约1500bp，我想知道这个RT-PCR产物是我想要的吗？理论上讲233个氨基酸对应的DNA应该是700左右。为什么大小差这么多呢？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-08-18 16:08:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sqhnsd

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by clbb1030 at 2010-08-18 16:08:31:
我从动物组织中分离纯化得到天然蛋白是233个氨基酸，然后在NCBI上找到它的序列，按照NCBI上提供的DNA序列设计引物，加限制性酶切位点。Total RNA为模板RT-PCR得到的片段约1500bp，我想知道这个RT-PCR产物是我想要 ...

应该不对，可能不是特异性扩增。你可以考虑重新设计一个引物。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2010-08-18 16:21:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2): 2010-08-18 22:06:12
233 AAs
假设没有任何信号肽或者其他翻译后剪切等，那么应该对应699个碱基编码，但是mRNA上面是会带有UTR区域，DNA序列的话还得加上内含子

我想这个东西应该就是UTR区域了，你看看NCBI的注释，会写哪里是UTR，你算算看对不对。另外既然都克隆出来了，就表达一下看看然后做WB鉴定下是不是
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2010-08-18 16:22:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
话说你测序了没……
赞一下 回复此楼
4楼2010-08-18 16:22:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

clbb1030

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-08-18 16:22:53:
话说你测序了没……

我没测序。不知道是不是我想要的东西就没去测序。
赞一下 回复此楼
5楼2010-08-19 09:11:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

clbb1030

木虫 (小有名气)
我用的引物是根据NCBI序列设计的，应该不会有问题。以前也用过文献上的引物，P出来好多条带。这个P出来的就是很单一的条带。
赞一下 回复此楼
6楼2010-08-19 09:13:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by clbb1030 at 2010-08-19 09:11:19:

我没测序。不知道是不是我想要的东西就没去测序。

测序才能确定哦~因为按照AAs的数目推算出来的mRNA碱基数是最最低的量了，UTR区域可以比编码区长很多很多，我见过有10kb的3UTR的基因
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2010-08-19 09:16:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jasco

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
还有种可能：不同转录本
比如说：你的233aa的蛋白是外显子1+3，而你rtpcr得到的是外显子1+2+3，所以长度变成1.5kb，

所以，也建议测序看看是什么，
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2010-08-19 10:17:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

clbb1030

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-08-19 09:16:13:


测序才能确定哦~因为按照AAs的数目推算出来的mRNA碱基数是最最低的量了，UTR区域可以比编码区长很多很多，我见过有10kb的3UTR的基因

我把这个片段连T载体上，转化之后，做蓝白斑筛选，居然长的全是白色的，一个蓝色的没有！而且密度超级高，也不知道是哪出问题了。最近试验做的特别不顺手。郁闷。
赞一下 回复此楼
9楼2010-08-20 08:33:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

clbb1030

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-08-19 10:17:19:
还有种可能：不同转录本
比如说：你的233aa的蛋白是外显子1+3，而你rtpcr得到的是外显子1+2+3，所以长度变成1.5kb，

所以，也建议测序看看是什么，

外显子1+3是什么意思呢，没太明白，高人指点一点。外显子1+2+3---这句没太明白。
赞一下 回复此楼
10楼2010-08-20 08:36:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 clbb1030 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +55 医学老男孩 2026-08-13 123/6150 2026-08-19 23:44 by stan_et
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +13 kkkl_v 2026-08-19 13/650 2026-08-19 22:37 by 宝贝虫子
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +12 基诺咪客 2026-08-17 16/800 2026-08-19 22:04 by kk 的小木虫
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 13/650 2026-08-19 21:28 by aasahr
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +4 yuleib84 2026-08-19 5/250 2026-08-19 19:52 by hhs666
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +10 wangze12014 2026-08-14 12/600 2026-08-19 16:56 by 苦难博士
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-19 09:56 by ZJTJZ
[基金申请] 什么时候开奖？ +6 CrisMessi 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:06 by Equinoxhua
[论文投稿] 投稿咨询 +4 wwm09 2026-08-17 6/300 2026-08-18 15:36 by wwm09
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +13 Ldrop2023 2026-08-13 16/800 2026-08-18 12:25 by 淀粉搬运工
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭