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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR片段大小问题
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clbb1030

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR片段大小问题 已有5人参与

我从动物组织中分离纯化得到天然蛋白是233个氨基酸，然后在NCBI上找到它的序列，按照NCBI上提供的DNA序列设计引物，加限制性酶切位点。Total RNA为模板RT-PCR得到的片段约1500bp，我想知道这个RT-PCR产物是我想要的吗？理论上讲233个氨基酸对应的DNA应该是700左右。为什么大小差这么多呢？
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1楼 2010-08-18 16:08:31
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by clbb1030 at 2010-08-18 16:08:31:
我从动物组织中分离纯化得到天然蛋白是233个氨基酸，然后在NCBI上找到它的序列，按照NCBI上提供的DNA序列设计引物，加限制性酶切位点。Total RNA为模板RT-PCR得到的片段约1500bp，我想知道这个RT-PCR产物是我想要 ...

应该不对，可能不是特异性扩增。你可以考虑重新设计一个引物。
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2楼2010-08-18 16:21:27
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2): 2010-08-18 22:06:12
233 AAs
假设没有任何信号肽或者其他翻译后剪切等，那么应该对应699个碱基编码，但是mRNA上面是会带有UTR区域，DNA序列的话还得加上内含子

我想这个东西应该就是UTR区域了，你看看NCBI的注释，会写哪里是UTR，你算算看对不对。另外既然都克隆出来了，就表达一下看看然后做WB鉴定下是不是
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3楼2010-08-18 16:22:19
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
话说你测序了没……
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4楼2010-08-18 16:22:53
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clbb1030

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-08-18 16:22:53:
话说你测序了没……

我没测序。不知道是不是我想要的东西就没去测序。
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5楼2010-08-19 09:11:19
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clbb1030

木虫 (小有名气)
我用的引物是根据NCBI序列设计的，应该不会有问题。以前也用过文献上的引物，P出来好多条带。这个P出来的就是很单一的条带。
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6楼2010-08-19 09:13:12
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by clbb1030 at 2010-08-19 09:11:19:

我没测序。不知道是不是我想要的东西就没去测序。

测序才能确定哦~因为按照AAs的数目推算出来的mRNA碱基数是最最低的量了，UTR区域可以比编码区长很多很多，我见过有10kb的3UTR的基因
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7楼2010-08-19 09:16:13
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jasco

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
还有种可能：不同转录本
比如说：你的233aa的蛋白是外显子1+3，而你rtpcr得到的是外显子1+2+3，所以长度变成1.5kb，

所以，也建议测序看看是什么，
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8楼2010-08-19 10:17:19
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clbb1030

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-08-19 09:16:13:


测序才能确定哦~因为按照AAs的数目推算出来的mRNA碱基数是最最低的量了，UTR区域可以比编码区长很多很多，我见过有10kb的3UTR的基因

我把这个片段连T载体上，转化之后，做蓝白斑筛选，居然长的全是白色的，一个蓝色的没有！而且密度超级高，也不知道是哪出问题了。最近试验做的特别不顺手。郁闷。
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9楼2010-08-20 08:33:02
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clbb1030

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-08-19 10:17:19:
还有种可能：不同转录本
比如说：你的233aa的蛋白是外显子1+3，而你rtpcr得到的是外显子1+2+3，所以长度变成1.5kb，

所以，也建议测序看看是什么，

外显子1+3是什么意思呢，没太明白，高人指点一点。外显子1+2+3---这句没太明白。
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10楼2010-08-20 08:36:43
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