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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 质粒PCR产物片段大小问题
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梧桐柒夕

主管区长 (文坛精英)

优秀区长优秀区长优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

[求助] 质粒PCR产物片段大小问题 已有3人参与

质粒为pUC57的大肠杆菌，质粒提取用的是自制试剂盒，经电泳过后确定是pUC57，然后用的是50μl的Taq体系进行的PCR扩增，引物自设的，将产物进行电泳时发现有两种不同的情况。其一是得到了400+的片段（此片段为正常片段），但同时做的相关平行组还得到了6000左右的片段。有没有相关PCR通透者可以解释一下，这个6000左右的片段会产生的原因？以及这个6000的片段是否正常？
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轻描淡写，浓墨重彩。
1楼 2014-06-08 16:37:20
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hailunl

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
梧桐柒夕: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-06-09 07:28:36
引用回帖:
4楼: Originally posted by 梧桐柒夕 at 2014-06-08 21:52:47
所有条件都是设计好的，已经是最优的了，如上述说的，部分组出现的是正常地，另一组出现的差异性很大，所以，想知道，在这个过程中，出现这么大片段的原因，是想知道，在怎样的情况下会出现这种情况，是所有产物连 ...

很明确告诉你，不可能是所有产物连在一起。什么转了一圈不一圈的，不要相信那些胡言乱语。我最讨厌不懂装懂。
你延伸时间多长扩出6K的片段？你延伸400左右的片段扩出这么长的，不可能转了一圈。
如果你真想找出原因，回收，测序，两端各测一个反应。测序时候把自己引物带上10ul.
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8楼2014-06-08 23:15:46
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hailunl

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梧桐柒夕: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-06-08 21:48:47
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-28 16:30:18
有非特异性很正常，PCR不能说明问题。
例如，引物特异性不好，或者退火温度过低，延伸时间过长都会出现非特异性条带，
只要有目标条带就可以了。
如果你想再检测，建议提高退火温度，质粒为模板，退火温度高点没事；延伸时间掌控在目标条带范围；另外，模板稀释10倍或50倍。
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2楼2014-06-08 19:11:00
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梧桐柒夕: 金币+5, ★有帮助 2014-06-08 21:53:33
你这个载体多大，是不是转了一圈了？这种事常有

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-06-08 19:35:27
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梧桐柒夕

主管区长 (文坛精英)

优秀区长优秀区长优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主
引用回帖:
2楼: Originally posted by hailunl at 2014-06-08 19:11:00
有非特异性很正常，PCR不能说明问题。
例如，引物特异性不好，或者退火温度过低，延伸时间过长都会出现非特异性条带，
只要有目标条带就可以了。
如果你想再检测，建议提高退火温度，质粒为模板，退火温度高点没 ...

所有条件都是设计好的，已经是最优的了，如上述说的，部分组出现的是正常地，另一组出现的差异性很大，所以，想知道，在这个过程中，出现这么大片段的原因，是想知道，在怎样的情况下会出现这种情况，是所有产物连在一起了么？
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轻描淡写，浓墨重彩。
4楼2014-06-08 21:52:47
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