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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 质粒PCR产物片段大小问题
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梧桐柒夕

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2楼: Originally posted by hailunl at 2014-06-08 19:11:00
有非特异性很正常，PCR不能说明问题。
例如，引物特异性不好，或者退火温度过低，延伸时间过长都会出现非特异性条带，
只要有目标条带就可以了。
如果你想再检测，建议提高退火温度，质粒为模板，退火温度高点没 ...

PCR过程中，所P的片段有可能形成聚合物么，就是产物片段在特殊情况下形成重复片段聚合在一起了~~~
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11楼2014-06-11 10:42:21
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梧桐柒夕: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-06-11 15:31:57
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-28 12:09:30
1.不可能转两圈，第一圈到引物那里就停下来了。就算没停下来也是多扩了引物端的几个碱基。
2.LZ你要扩400bp的产物，延伸时间肯定不会超过1min的，除非用的快速高保真那种酶，从速度上说也是不可能转圈的。
3.LZ你说你的产物片段聚合在一起。这个问题就复杂了。你的基因是多重复序列吗？一般用反向PCR或者POE—PCR直接扩载体的时候条件不太好会出现多聚物聚集在点样孔跑不出来的现象。至于一般的从载体上扩基因会有杂带，但是这种复杂多聚物的情况至少我没遇见过啊。
4.你的体系里除了载体就是扩出来的片段，如果你想探查原因的话，回收6000的片段做个双酶切算了。如果切出来载体带了，那说明这6000至少还是载体参与形成的。如果有基因的带了那真有可能像你说的多聚物。
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12楼2014-06-11 15:23:49
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梧桐柒夕

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12楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-11 15:23:49
1.不可能转两圈，第一圈到引物那里就停下来了。就算没停下来也是多扩了引物端的几个碱基。
2.LZ你要扩400bp的产物，延伸时间肯定不会超过1min的，除非用的快速高保真那种酶，从速度上说也是不可能转圈的。
3.LZ你 ...

首先，关于前三个的，第一条有人指出是不可能的了，第二条，延伸时间30s每个循环，条件都是合适的，有两组是正常的400+bp，第三个，重复序列是一个老师提出的建议，他们也有出现过聚合物的情况，现在在做产物纯化，想验证另一个想法，关于你说的双酶切，多谢建议，我查查之后再做一下。喔，关于你说的多聚物聚集在点样孔跑不出的现象，是没有的，电泳采用的Marker是5000的，有两组是400+，有三组是在5000以上的部分，很干净的条带，是可以跑动的。
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13楼2014-06-11 15:31:48
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 梧桐柒夕 at 2014-06-11 15:31:48
首先，关于前三个的，第一条有人指出是不可能的了，第二条，延伸时间30s每个循环，条件都是合适的，有两组是正常的400+bp，第三个，重复序列是一个老师提出的建议，他们也有出现过聚合物的情况，现在在做产物纯化， ...

1.如果考虑重复序列的话还是得关注你的基因，因为载体肯定是不会有那么多重复序列的。
2.这个6000的片段很影响你下面的实验吗？不影响的话为什么纠结在这里呢
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14楼2014-06-11 16:47:25
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梧桐柒夕

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14楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-11 16:47:25
1.如果考虑重复序列的话还是得关注你的基因，因为载体肯定是不会有那么多重复序列的。
2.这个6000的片段很影响你下面的实验吗？不影响的话为什么纠结在这里呢...

因为就是研究这个的呀~也不能说的太详细，就是想知道我P出来的这些个400+的片段为什么会变成6000+。以为不了解，所以云里雾里的。嘤嘤。
如果找出原因，就不用再往下做了，这个是没有后续试验的。
我所说的重复序列多聚物，就是指这些400+的片段在某种特定条件下形成了重复序列的多聚物，有这个可能么？
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15楼2014-06-11 17:47:09
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梧桐柒夕

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引用回帖:
2楼: Originally posted by hailunl at 2014-06-08 19:11:00
有非特异性很正常，PCR不能说明问题。
例如，引物特异性不好，或者退火温度过低，延伸时间过长都会出现非特异性条带，
只要有目标条带就可以了。
如果你想再检测，建议提高退火温度，质粒为模板，退火温度高点没 ...

您好，问一下，您在做PCR的时候，有出现过P出的片段不是所需片段的时候么？
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16楼2014-07-28 11:32:28
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