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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 质粒PCR产物片段大小问题
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梧桐柒夕

主管区长 (文坛精英)

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[求助] 质粒PCR产物片段大小问题 已有3人参与

质粒为pUC57的大肠杆菌，质粒提取用的是自制试剂盒，经电泳过后确定是pUC57，然后用的是50μl的Taq体系进行的PCR扩增，引物自设的，将产物进行电泳时发现有两种不同的情况。其一是得到了400+的片段（此片段为正常片段），但同时做的相关平行组还得到了6000左右的片段。有没有相关PCR通透者可以解释一下，这个6000左右的片段会产生的原因？以及这个6000的片段是否正常？
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轻描淡写，浓墨重彩。
1楼 2014-06-08 16:37:20
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梧桐柒夕

主管区长 (文坛精英)

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引用回帖:
12楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-11 15:23:49
1.不可能转两圈，第一圈到引物那里就停下来了。就算没停下来也是多扩了引物端的几个碱基。
2.LZ你要扩400bp的产物，延伸时间肯定不会超过1min的，除非用的快速高保真那种酶，从速度上说也是不可能转圈的。
3.LZ你 ...

首先，关于前三个的，第一条有人指出是不可能的了，第二条，延伸时间30s每个循环，条件都是合适的，有两组是正常的400+bp，第三个，重复序列是一个老师提出的建议，他们也有出现过聚合物的情况，现在在做产物纯化，想验证另一个想法，关于你说的双酶切，多谢建议，我查查之后再做一下。喔，关于你说的多聚物聚集在点样孔跑不出的现象，是没有的，电泳采用的Marker是5000的，有两组是400+，有三组是在5000以上的部分，很干净的条带，是可以跑动的。
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轻描淡写，浓墨重彩。
13楼2014-06-11 15:31:48
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hailunl

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梧桐柒夕: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-06-08 21:48:47
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-28 16:30:18
有非特异性很正常，PCR不能说明问题。
例如，引物特异性不好，或者退火温度过低，延伸时间过长都会出现非特异性条带，
只要有目标条带就可以了。
如果你想再检测，建议提高退火温度，质粒为模板，退火温度高点没事；延伸时间掌控在目标条带范围；另外，模板稀释10倍或50倍。
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2楼2014-06-08 19:11:00
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梧桐柒夕: 金币+5, ★有帮助 2014-06-08 21:53:33
你这个载体多大，是不是转了一圈了？这种事常有

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-06-08 19:35:27
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梧桐柒夕

主管区长 (文坛精英)

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引用回帖:
2楼: Originally posted by hailunl at 2014-06-08 19:11:00
有非特异性很正常，PCR不能说明问题。
例如，引物特异性不好，或者退火温度过低，延伸时间过长都会出现非特异性条带，
只要有目标条带就可以了。
如果你想再检测，建议提高退火温度，质粒为模板，退火温度高点没 ...

所有条件都是设计好的，已经是最优的了，如上述说的，部分组出现的是正常地，另一组出现的差异性很大，所以，想知道，在这个过程中，出现这么大片段的原因，是想知道，在怎样的情况下会出现这种情况，是所有产物连在一起了么？
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轻描淡写，浓墨重彩。
4楼2014-06-08 21:52:47
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