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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 胶回收 连接
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周兵lofter

新虫 (小有名气)

[求助] 胶回收 连接 已有4人参与

胶回收的产物是不纯的 有4000和2000. 但我想进行连接转化，之后挑菌，做菌液pcr，但跑胶后出现的都是2000的。4000的没连进去。请问的是能不能延长连接反应时间解决这个问题。
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1楼 2014-06-06 10:41:03
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-06-06 12:36:29
既然2k和4k
你为什么不跑的长点，然后单独切出来4k啊？
延长连接时间，是可以让链接效率提高
但是问题是，4k的提高比起2k的提高，可以忽略不计
另外，在生长过程中，4k的会很快被2k的给掩盖过去
最后你只能挑出2k的片段，4k的可能只有不到百分之一，那工作量啊，太大了

强烈建议你重新切胶，我们相隔200bp的都可以切开
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天行健
2楼2014-06-06 10:53:08
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周兵lofter

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-06-05 20:53:08
既然2k和4k
你为什么不跑的长点，然后单独切出来4k啊？
延长连接时间，是可以让链接效率提高
但是问题是，4k的提高比起2k的提高，可以忽略不计
另外，在生长过程中，4k的会很快被2k的给掩盖过去
最后你只能挑出 ...

亲  我也是这么想的 胶回收胶回收。也分的很开  然后切。。。但还是有2000的条带。。然后我接着在做胶回收，最后一次只能隐约的看到上面那条了。。。但连接转化后，没有长出菌落。。。  但是最后这次我是不能确定有没有2000了，因为4000的条带也很微弱了。。。
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3楼2014-06-06 11:07:38
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grase

捐助贵宾 (职业作家)

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
周兵lofter(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-06-06 12:36:50
引用回帖:
3楼: Originally posted by 周兵lofter at 2014-06-06 11:07:38
亲  我也是这么想的 胶回收胶回收。也分的很开  然后切。。。但还是有2000的条带。。然后我接着在做胶回收，最后一次只能隐约的看到上面那条了。。。但连接转化后，没有长出菌落。。。  但是最后这次我是不能确定有 ...

4000的再扩增点吧。可以过夜连，连时间长点。
如果量少，阳性克隆也少。
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4楼2014-06-06 11:14:08
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
周兵lofter(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-06 19:18:20
将胶回收的产物再次进行PCR，电泳切出特异条带，然后胶回收。。。。。。
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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
5楼2014-06-06 13:37:58
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周兵lofter

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-06-05 23:37:58
将胶回收的产物再次进行PCR，电泳切出特异条带，然后胶回收。。。。。。

漂亮  我也想这样。。。那么这次的pcr用的引物和上次的一样哦 是吧
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6楼2014-06-09 15:29:55
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周兵lofter

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-06-05 20:53:08
既然2k和4k
你为什么不跑的长点，然后单独切出来4k啊？
延长连接时间，是可以让链接效率提高
但是问题是，4k的提高比起2k的提高，可以忽略不计
另外，在生长过程中，4k的会很快被2k的给掩盖过去
最后你只能挑出 ...

亲  咱把胶回收后的产物  做模版， 用原来的引物，在做一次pcr。这样会出现什么样的条带呢？
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7楼2014-06-09 20:19:32
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主
引用回帖:
7楼: Originally posted by 周兵lofter at 2014-06-09 20:19:32
亲  咱把胶回收后的产物  做模版， 用原来的引物，在做一次pcr。这样会出现什么样的条带呢？...

是你的引物还算特异，即便不特异，扩出来的2k不在4k里，那样比较理想，应该全是4k的，相当于巢式

你扩增的时候，2k和4k的亮度对比如何，如果二者扩增效率差不多，那么这样倒不失为一个好方法，如果2k的扩增效率高的话，额，不好说
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天行健
8楼2014-06-10 09:13:27
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

LZ的意思是割胶回收4K的条带里还有2K的？？？割胶的胶块过大了吧。。。建议用0.8% 甚至0.6的胶把这两条带彻底跑开了再切胶。
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大家相互帮助哈
9楼2014-06-10 13:03:11
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周兵lofter

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-06-09 19:13:27
是你的引物还算特异，即便不特异，扩出来的2k不在4k里，那样比较理想，应该全是4k的，相当于巢式

你扩增的时候，2k和4k的亮度对比如何，如果二者扩增效率差不多，那么这样倒不失为一个好方法，如果2k的扩增效率 ...

我今天 算是做错了吧  我用的东西都是walking的，就是模版用的胶回收的产物。其实本来打算就是普通的pcr，但是习惯设计成了walking的步骤了。看看跑出什么来吧。。。
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10楼2014-06-10 13:25:43
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