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求助！新人，融合PCR一直融不上！！！ 已有6人参与
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我做的是三片段融合，大小分别是1039、720、980，融合片段大小为2739bp，分别先p出来，退货、、退火温度都是53度，然后进行融合，条件是 50μl 体系： 10xPCR buffer 5μ dNTP 5μ 上游正向引物AF1 2μ 下游反向引物AR2 2μ 同源臂1（1039）（7.7ng/μl） 各加50ng左右作为模板 同源臂2（720）（24.6ng/μl） 同源臂3（980）（11.8ng/μl） ddH2O2 补至50μ Taq酶 0.25μ 预变性 94 ℃ 5min 变性 94 ℃ 30s 复性 53 ℃ 30s 30个循环 延伸 72 ℃ 3min 延伸 72 ℃ 10min 保存 4℃ 一直就融不上，后来降低退火温度升高退火温度都融不上，也设了梯度了，好奇怪三个片段的温度都是53度为什么最后融合53度就是融不上呢？？难道是因为Taq酶加A尾了吗？但是我师兄做的是两片段融合就用的Taq酶啊，就融上了！为毛线！！！！求指点！！！！真是做了一学期了快！ 下面上电泳图！ 一直都是引物二聚体很亮，目的条带啥也没有！！！！  除了marker什么也没p出来的电泳图.jpg |
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2楼2014-06-03 20:20:23
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1. 融合PCR最好不要用Taq酶，既然楼主都知道末端加尾的问题。 2. 直接用普通PCR程序恐怕难以扩增出目的条带。不知道你同源臂相互匹配的片段有多长？建议：（1）适当延长退火时间，如果匹配片段比较长，提高退火温度。（2）减少循环数，比如10-15个循环，然后取2-5uL直接用于下一轮PCR的模板（不用跑电泳），用全长基因两端的引物扩增。如果参数调整恰当，应该可以做出来。祝实验顺利！ |
5楼2014-06-04 08:15:40
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